Мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами. Размеры: 0,7 -1,5 мкм. в поперечнике, 2-5 мкм в длину. Подвижные микроорганизмы (перитрихи), но встречаются неподвижные варианты. Некоторые имеют микрокапсулу.

Культуральные свойства

Факультативные анаэробы, хемоорганогетеротрофы, оптимальная температура роста 37 0 С, значение рН 6,8-7,2. Хорошо растут на простых питательных средах. В МПБ образуют диффузное помутнение (S – форма) или осадок (R – форма). На МПА колонии меньшего размера, чем E. coli, полупрозрачные, нежные. Могут расти в виде R-, S-, Q- колоний. В качестве накопительной среды используется селенитовый бульон. На дифферициально-диагностических средах эндо Левина и Плоскирева вырастают в виде прозрачных или беловатых колоний, что отличает их от окрашенных в цвет индикатора колоний E. coli. На висмут-сульфитном агаре (среда Вильсон-Блер) образуют колонии черного цвета, с металлическим блеском, окруженные черным ободком прокрашенной среды. После снятия колонии на агаре остается темное пятно.

В отличии от S.paratyphi - А, большинство штаммов S.paratyphi – В при росте на агаре способны образовывать по краю колоний слизистый валик.

Биохимические свойства:

Биохимические и антигенные свойства сальмонелл являются основными для их видовой дифференциации. Возбудители паратифов биохимически более активны, чем брюшнотифозная палочка. Сальмонеллы не ферментируют лактозу и сахарозу. Глюкозу, манит, мальтозу расщепляют до кислоты (брюшнотифозные) или до кислоты и газа (паратифозные). По способности разлагать ксилозу и арабинозу различают 4 типа: К+А+; К-А-; К+А-; К-А+. Индол не образуют, желатин не разжижают, образуют H 2 S (в отличие от шигелл) переводят нитраты в нитриты. Сальмонеллы - оксидазоотрицательные, каталазоположительные, реакция Фогес-Проскауэра – отрицательная

Антигенная структура

Антигенная структура сальмонелл – довольно сложная , имеются О-, Н-, Vi-, М- антигены.

О- антиген - липолисахаридно-протеиновый комплекс, термостабильный (выдерживает кипячение в течение 2,5 часов, автоклавирование при 120 0 С – 30 мин.), чувствительны к формальдегиду, но устойчивы к спирту. Это - групповой антиген – по нему, согласно классификации Кауфмана и Уайта, семейство делится на 67 серогрупп. Их обозначают заглавными буквами латинского алфавита (А, В, С, Д и т.д.). Некоторые группы имеют общие О-антигены, но каждая группа содержит один основной антиген. (Например, в группе А – это - 2, в группе В – 4, в группе С – 6, Д – 9 и т.д.)

Н- антиген – белковый, типоспецифический (делит сальмонеллы на серовары), термолабильный, разрушается при нагревании до 75 0 -100 0 С, а также под действием соляной кислоты, спирта, протеолитических ферментов. На этом основано получение Н- диагностикумов. У Н- антигенов сальмонелл различают 2 фазы. Первая из них (специфическая) различна у серотипов, входящих в одну группу. Сальмонеллы этой фазы обозначаются строчными латинскими буквами от а до z. Сальмонеллы, имеющие Н- антигены II фазы (неспецифической) содержат в своем составе общие для всей группы компоненты; эта фаза обозначается арабскими цифрами.

Vi- антиген – поверхностный (капсульный), термолабильный, чувствительный к соляной кислоте и спирту, разрушается при кипячении за 10 мин. Он препятствует агглютинации сальмонелл О- антисыворотками. Vi- антиген встречается только у вирулентных сальмонелл. Он не является прямым носителем вирулентности, однако установлен параллелизм между его присутствием и действием бактерий на макроорганизм.

М- антиген – слизистый, водонерастворимый, разрушается под действием кислот и спиртов.

Несмотря на многочисленность антигенов, при серологической идентификации во внимание принимаются 3 из них: О-, Н-, Vi.

Факторы патогенности:

а) токсины : эндотоксин (липополисахаридопротеиновый комплекс), образуют микроорганизмы в S- форме, высвобождается при массовой гибели возбудителей; играет основную роль в патогенезе брюшного тифа;

б) ферменты патогенности : гиалуронидаза, фибринолизин, лецитиназа;

в) структурные элементы клеток : фимбрии, микрокапсула (у некоторых штаммов), за счет ее возбудители прикрепляются к клеткам эпителия тонкого кишечника;

г) важная биологическая особенность сальмонелл -способность проникать в макрофаги и противостоять фагоцитозу, а после их гибели попадать в кровь, обусловливая генерализацию инфекционного процесса;

д) пили I порядка выполняют адгезивную функцию.

Резистентность.

Сальмонеллы относительно устойчивы во внешней среде. Во льду сохраняются более 60 дней, в воде открытых водоемов – 120 суток, в замороженном мясе – 6-13 месяцев, в хлебе – до 3-х месяцев, в яйцах – до 13 месяцев, в почве – до 3-х месяцев. При нагревании возбудители быстро погибают. Чувствительны к дезрастворам в рабочей концентрации (0,3 % раствор хлорамина убивает сальмонелл за 1 час).

Эпидемиология.

Резервуар и источник возбудителей брюшного тифа и паратифа А – человек (больной или бактерионоситель); резервуаром паратифа В могут быть не только люди, но и животные (крупный рогатый скот, свиньи, домашняя птица).

Механизм заражения – фекально-оральный; пути передачи: пищевой, водный, контактно-бытовой. Брюшной тиф и паратиф А распространяются чаще водным путем (употребление воды из неглубоких загрязненных водоемов, технических водопроводов, в случаях прорыва канализационных вод). При паратифе В преобладает пищевой путь (заражение чаще происходит через молоко, молочные продукты, кремы, овощные салаты). Бытовой путь реализуется, как правило, через бактерионосителей; при этом большое значение имеет низкая санитарная культура.

Брюшной тиф регистрируется повсеместно во всех климатических зонах. Паратиф А встречается чаще всего в странах Юго-Восточной Азии, Африки в виде спорандических случаев или в виде ограниченных вспышек

Наиболее высокий уровень заболеваемости регистрируется в развивающихся странах. В РФ при невысокой средней встречаемости данной патологии есть регионы с высокими показателями заболеваемости. Так, в последние годы они довольно часто регистрируются в Дагестане, Карачаево-Черкесии, Калининградской области, Приморском крае. Это связано с миграцией населения, расширением уличной торговли пищевыми продуктами и вытекающими из этого последствиями.

В мясопептонный бульон добавляют 3-4% агара, доводят pH до 7,6, разливают в склянки по 100 мл и стерилизуют, как обычно, в автоклаве, сохраняя в таком виде до момента приготовления фуксинсульфитного агара. Готовят фуксинсульфитный агар в день использования. Заготовлять впрок и хранить эту среду нельзя, так как она быстро краснеет.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до 70°С 3-4%-ного мясопептонного агара стерильно добавляют 1 г лактозы, предварительно растворив и прокипятив ее в 5 мл стерильной воды. Кроме того, сюда же добавляют 0,5 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2,5 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора сернистокислого натра. Сернистокислый натр (Na2SO3) в количестве 0,5 г растворяют в 5 мл воды и перед употреблением стерилизуют кипячением.

Можно поступить и несколько иначе. Фуксин и сульфит натрия сначала смешивают в пробирке: к 0,5 мл раствора фуксина прибавляют при встряхивании раствор сульфита натрия до тех пор, пока жидкость в пробирке не станет бесцветной или слегка розовой. И в расплавленный и несколько охлажденный агар вливают уже эту смесь. Колбу со средой тщательно встряхивают для перемешивания и среду разливают в чашки Петри. После застывания среды ее подсушивают в термостате при 37 °С в течение 30 мин.

В горячем состоянии среда должна быть слабо-розового цвета, а после остывания совершенно бесцветной. Обесцвечивание фуксина в среде Эндо вызывает введенный сернистокислый натр.

Среда Симмонса

При идентификации микробов группы коли (чтобы отличить почвенный вид Escherichia coli aёrogenes от фекального вида Escherichia coli commune) применяется цитратная среда Симмонса. В 1 л дистиллированной воды растворяют 1,5 г фосфорнокислого натра (или однозамещенного фосфорнокислого аммония), 1 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РO4), 0,2 г сернокислого магния, 2,5-3 г кристаллического лимоннокислого натрия, устанавливают pH 7,0-7,2, добавляют 2% агара и, расплавив среду, разливают ее в колбы по 100 мл. Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 120°С.

Перед употреблением в среду необходимо добавить индикатор. Можно использовать либо бромтимолблау, либо фенолрот. Индикатор добавляют к 100 мл расплавленной среды. Бромтимолблау берут в количестве 1 мл спиртового 1,5%-ного раствора. Среда приобретает оливково-зеленый цвет. Фенолрот добавляется в количестве 2 мл 1,5%-ного спиртового раствора. Среда окрашивается в желтый цвет. После добавления индикатора среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 мин.

Пестрый ряд углеводов, или среды Гисса

Для определения ферментативной способности микроорганизмов пользуются средами Гисса. В зависимости от наличия в микробной клетке того или иного фермента она способна разлагать какой-либо один из углеводов с образованием определенных продуктов разложения, поэтому в состав среды вводится какой-либо углевод: лактоза, глюкоза, маннит, сахароза и пр. Набор таких сред получил название «пестрого ряда углеводов».

Сначала готовят пептонную воду: на 1 л дистиллированной воды берут 10 г пептона и 5 г химически чистой поваренной соли, кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный фильтр (фильтрат должен быть совершенно прозрачным) и устанавливают pH 7,2-7,4. Затем к 100 мл пептонной воды добавляют по 0,5 г одного из применяемых углеводов и по 1 мл индикатора Андреде.

В состав индикатора Андреде входит: 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 1 н. раствора едкого натра (NaOH) и 100 мл дистиллированной воды. При необходимости индикатор можно готовить заранее и сохранять его в темном месте, предварительно про-кипятив при 100 °С в течение 15 мин. После введения индикатора среды разливают по пробиркам с поплавками и стерилизуют в кипятильнике Коха трижды по 30 мин. По окончании стерилизации поплавки должны быть погружены в среду, в противном случае пробирка не может быть использована. Среды Гисса с реактивом Андреде имеют соломенно-желтый цвет без розового оттенка. При развитии в среде микроорганизмов последние, разлагая сахар с образованием кислоты, вызывают изменение реакции. А так как в кислой среде индикатор Андреде краснеет, то это и является свидетельством, что микроорганизм использует данный сахар для своей жизнедеятельности. Отсутствие покраснения, наоборот, свидетельствует об отсутствии в ферментативном комплексе изучаемого микроба фермента, разлагающего имеющийся в среде углевод.

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. Она позволяет установить видовую и типовую принадлежность, определить биологические варианты микроба. Существует целый ряд ферментов, по активности которых можно определить степень патогенности микроорганизма.

Для определения ферментативной (биохимической) активности микробов используют дифференциально – диагностические среды.

К дифференциально – диагностическим средам относятся среды Гисса, на которых изучается сахаролитическая активность микрооганизмов.

Среды Гисса могут быть жидкими и плотными. Основу сред Гисса составляют мясо – пептонный бульон (МПБ) и мясо – пептонный агар (МПА). В состав этих сред входит углевод и индикатор. Существуют два ряда сред Гисса – большой (включающий 27 наименований) и малый. Малый ряд сред Гисса включает мальтозу, глюкозу, сахарозу, манит и лактозу. Исходная установка рН среды – слабо щелочная (7,2 – 7,4).

Если при культивировании микробов происходит расщепление субстрата до кислоты, то рН среды изменяется в кислую сторону и при этом происходит изменение цвета индикатора. Изменение цвета питательной среды и является показателем наличия у данного микроба фермента, расщепляющего конкретный субстрат до кислоты. И в жидкой, и в плотной питательной среде о наличии фермента, расщепляющего субстрат до кислоты, судят по изменению цвета индикатора.

Образование газа устанавливают по скоплению пузырьков газа в толще агара и по разрыву агара (если среды Гиса плотные) или по скоплению пузырьков газа в поплавке (если среды жидкие). Поплавок – узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращенным вверх, которую помещают в пробирку со средой перед стерилизацией среды.

Различие в наборе ферментов, расщепляющих углеводы, может быть использовано при дифференцировке родственных микробов, например, сальмонелл, шигелл, эшерихий. Так, на средах Эндо, Левина, Плоскирева, в состав которых входит лактоза и индикатор (анилиновый краситель), колонии кишечной палочки будут окрашены в фиолетовый цвет (на среде Левина) или в сиреневый (на средах Эндо и Плоскирева). Колонии сальмонелл и шигелл на этих же средах будут бесцветными.

Это обусловлено тем, что кишечная палочка, имея фермент лактазу, расщепляет лактозу, в результате чего образуется кислота, рН среды смещается в кислую сторону и происходит проявление цвета индикатора – анилинового красителя. Особи кишечной палочки хорошо окрашиваются анилиновым красителем, а совокупность окрашенных особей представляет окрашенную колонию.

Шигеллы и сальмонеллы не имеют фермента лактазы и не расщепляют лактозу, рН среды не изменяется, индикатор не проявляется, микробные клетки не окрашиваются. Поэтому колонии сальмонелл и шигелл на средах Эндо и Плоскирева будут бесцветными.

О наличии фермента амилазы можно судить, посеяв культуру на среду, содержащую крахмал. Если есть фермент, расщепляющий крахмал, то при добавлении в пробирку капли раствора Люголя, посинение среды не произойдет. Нерасщепленный крахмал при добавлении раствора Люголя дает синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т.е. способность расщеплять белки, полипептиды и пр.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих желатин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен.

При расщеплении пептоном могут выделяться индол, скатол, сероводород, аммиак. Их образование устанавливают с помощью индикаторов. Например, фильтровальную бумагу заранее пропитывают раствором индикатора, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 – 6 см и после посева культуры на МПБ помещают под пробку (между пробкой и стенкой пробирки). После инкубации в термостате учитываю результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной 20% раствором ацетата свинца и гидрокарбоната натрия, происходит образование сульфата свинца – соли черного цвета, и индикаторная бумажка чернеет. Индол способствует покраснению бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Гемолитические свойства микробов можно выявить, используя кровяной агар. Если микроб имеет фермент гемолизин, то вокруг колоний этого микроба будут зоны лизиса эритроцитов (в этих зонах агар будет бесцветным).

Фермент лецитиназу выявляют при посеве культуры на желточно – солевой агар. Вокруг колонии микроба, продуцирующего этот фермент, образуется матовый ореол.

Следует помнить о том, что наличие различных ферментов определяет биохимические свойства микробов.

Культуральные и биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции

Ферментный состав любого микроорганизма является достаточно постоянным признаком в нормальных условиях, т.е. различные виды микроорганизмов различаются по набору ферментов.

Изучение ферментного состава имеет важное значение для дифференцировки и идентификации различных микроорганизмов.

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена.

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4.

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки - в розовый.

Методы культивирования

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ - наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбудителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на различных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёрдых средах бактерии формируют колонии - изолированные структуры, образующиеся в ре зультате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размножения одной или нескольких клеток. Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных средах имеет больше характерных особенностей.

Некоторые бактерии выделяют гемолизины - вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и соответственно - размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14). Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.

α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску.

В бактериологической практике чаще всего изучают сахаролитические и протеолитические ферменты

Подобный рост характерен для пневмококка, а также для группы так называемых зеленящих стрептококков.

β-Гемолиз. Гораздо большая группа бактерий вызывает полное разрушение эритроцитов, или β-гемолиз. Их колонии окружены прозрачными зонами различного размера. Например, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aureus образуют большие зоны гемолиза, a Listeria monocytogenes или Streptococcus agalactiae - небольшие, диффузные зоны. Для определения гемолитической активности не следует применять шоколадный агар (ША), так как образующиеся зоны α- или β-гемолиза не имеют характерных особенностей и вызывают одинаковое позеленение среды.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний - их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний - признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев колонии грамположительных бактерий мельче колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавленный или приподнятый центр. Другой важный признак - форма краёв колоний. При изучении формы колоний учитывают характер её поверхности: матовый, блестящий, гладкий или шероховатый. Края колоний могут быть ровными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы колоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны как диссоциации. Наиболее часто обнаруживают S — и R — duc социации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии - неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

Цвет колоний

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже - красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специальных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, колонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Консистенция колоний и особенности роста на среде

Полезную информацию могут дать консистенция колоний и особенности роста на среде. Обычно эту информацию можно получить при прикосновении к колониям петлёй. Колонии могут легко сниматься со среды, врастать в неё или вызывать её коррозию (образуя трещины и неровности). Консистенция колоний может быть твёрдой или мягкой.Мягкие колонии - маслянистые или сливкообразные; могут быть слизистыми (прилипают к петле) или низкими (тянущимися за петлёй).

Твёрдые колонии - сухие, восковидные, волокнистые или крошковатые; могут быть хрупкими и ломаться при прикосновении петлёй.

Запах - менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий - молочной сыворотки, протеев - гнилостный запах, нокардий - свежевскопанной земли.

Биохимические методы идентификации бактерий

Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

Способность к ферментации углеводов

Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающих изменение окраски индикатора.

«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

Стеклянные поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Расщепление белков

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты - аммиак, индол и сероводород - сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Образование индола и H2S. Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты (при образовании индола бумажка краснеет),во втором - раствором ацетата свинца (при образовании H 2 S бумажка чернеет).Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (например, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность

Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет определить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Способность к восстановлению NO3 в N02, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса. При положительном результате наблюдают появление красного кольца.

Хроматография

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования - жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий. Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии. Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий. У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.

Индикаторные бумажки

Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов.

Система индикаторных бумажек (СИБ) - набор дисков, пропитанных различными субстратами. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемые бактерии. Так, на практике применяют наборы Minitek Enterobacteriaceaelll и Minitek Neisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) и нейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при 37 °С.

Наборы мультимикротестов - пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируют при 37 °С. На практике используют тесты RapID NH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.

Автоматические системы идентификации бактерий

Автоматические системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрее обычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получили системы типа Microscan и Vitek.

Системы Microscan. Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентные методы идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа - 2 ч). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа - 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована и автоматически проводит все необходимые расчёты.
Системы Vitek. В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками. В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке. В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Система полностью компьютеризирована и работает автоматически.

Методы идентификации нуклеиновых кислот

Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот. Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты. Широкому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеиновых кислот.

Метод гибридизации на твёрдой основе и его сэндвич- модификация распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.

Биохимическая идентификация бактерий с помощью тест-систем

Другие варианты подобных тест-систем предусматривают адсорбцию дифференцирующих субстратов на бумажных или полимерных носителях. Среди них распространены системы Auxtab, Minitek, Morlok, MICRO-ID.

Подобные системы удобны в пользовании, они позволяют одновременно исследовать широкий спектр микробных признаков, всегда готовые к использованию в любых микробиологических лабораториях, они простые и надежные, требуют небольших объемов посевного материала, потому экономят лабораторную посуду, пипетки. Компьютерная обработка полученных результатов дает возможность быстро определить и оценить вид неизвестного возбудителя.

Изготовление питательных сред. В состав любых сред входят преимущественно натуральные животные или растительные продукты и компоненты – мясо, рыбная мука, яйца, молоко, кровь, дрожжевой экстракт, картофель и тому подобное. Из них готовят специальные полуфабрикаты в виде экстрактов, настоев, ферментативних и кислотных гидролизатів (мясная вода, дрожжевой экстракт, триптичнийгидролизатХоттингера, пептон и другие), которые являются основой для последующего конструирования питательных сред. Кроме этого, в питательные среды добавляют разные неорганические соли в зависимости от потребностей микробной клетки. Как правило, концентрация хлорида натрия составляет 5,0 г/л, KH2PO4 – 0,2-0,5 г/л, MgSO4·7H2O, другие соли добавляются из расчета 0,001 г/л. В необходимых случаях к составу вводят углеводы (сахара, многоатомные спирты), аминокислоты в концентрации 0,5-1,0 %, а также витамины (до 0,001 мг/мл).

Для обеспечения необходимой плотности среды используют агар-агар, который получают из морских водорослей. Он является удобным и необходимым компонентом сред, поскольку не потребляется бактериями как ростовой субстрат. Образовывая в воде гель, он плавится при температуре возле 100 °С, а густеет при 40 °С. Источником желатина являются богатые на коллаген субстраты. Среди них хрящи, сухожилия, кости и тому подобное. Гель, который получают в результате использования желатина, плавится при температуре возле 32-34 °С и застывает при 28 °С. Однако многочисленные микроорганизмы способны расщеплять желатин, потому использование последнего как наполнителя среды считается нецелесообразным. Чаще всего такие среды с желатином применяются для определения протеолитических свойств бактерий.

Изготовление питательных сред является сложным динамическим процессом, который нуждается во внимании бактериолога. Этот процесс состоит из нескольких основных этапов. Сначала к дистиллированной воде согласно с прописью добавляют необходимые сухие компоненты среды, тщательным образом перемешивают, растворяя при нагревании. Обязательно устанавливают рН среды, которую определяют или с помощью іонометра, или индикаторными бумажками. При этом следует обратить внимание, что после стерилизации реакция среды падает на 0,2. Среды, которые содержат агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем состоянии, жидкие среды – через бумажные фильтры. Если есть необходимость, их освітляють осаждением или с помощью белка куриного яйца или сыворотки. Среды разливают в специальные матрасы, колбы, флаконы и закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды используют разные режимы стерилизации. Да, среды, которые содержат углеводы, желатин стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112 °С или текучей парой при температуре 100 °С дробно. Среды без углеводов можно стерилизовать в автоклаве при 115-120 °С в течение 20 мин. Если в состав сред входят неустойчивые к температуре компоненты, такие, как нативний белок, сыворотка, мочевина, то они стерилизуются или фильтрованием через бактериальные фильтры, или их добавляют готовым в стерильную среду. Контроль стерильности сред осуществляют путем витримування их в термостате в течение нескольких суток при температуре 37 °С.

Приводим примеры изготовления некоторых простых питательных сред, которые чаще всего используются в микробиологической практике и могут быть основой для изготовления более сложных.

Мясная вода . Для ее изготовления используют свежую говядину, которую предварительно очищают от жира, фасций, сухожилий и тому подобное, разрезают на мелкие куски и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, размешивают и на сутки оставляют в прохладном месте. Полученный настой кипятят в течение 30-60 мин, периодически снимая накипь, а затем отстаивают. Отделяют жидкость от фарша, фильтруют через фильтровальную бумагу или полотно и доливают водопроводной водой к первичному объему, потом разливают в флаконы и стерилизуют при 1 атмосфере (температура 120 °С) в течение 30 мин. Стерильная мясная вода прозрачна, имеет желтоватый цвет, а на стенках флакона и на дне образуется осадок из белков, которые свертывались. Потому при последующем использовании среды его опять фильтруют. Активная реакция среды – 6,2.

Мясо-пептонныйбульйон (МПБ). Чтобы изготовить МПБ, к мясной воде добавляют 1 % пептону и 0,5 % хлориду натрия, устанавливают необходимое рН с помощью 20 % раствору NAOH и кипятят 30-40 мин, постоянно перемешивая. Бульйон фильтруют через бумажный или полотняный фильтры, разливают в флаконы, пробирки, проверяют активную реакцию среды и стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.

М’ясо-пептоннийагар (МПА). К мясо-пептонного бульйону добавляют мелко нарезанный агар-агар (2-2,5 %). Полученную смесь кипятят к растворению агар-агара, фильтруют, устанавливают рН и разливают в флаконы. Стерилизацию проводят в течение 20 мин при температуре 120 °С.

Среды с кровью, сывороткой или асцитическойжидкостью. Поскольку эти среды не могут долго сохраняться, их готовят непосредственно перед применением. Для этого к растопленному и охлажденному до 45-50 °С МПА додают стерильно 5-10 % свежей или дефибринированной крови барана, кролика или другого животного. Флаконы с агаром тщательным образом перемешивают и разливают в чашки Петри, следя за отсутствия пены.

Идентично готовят сывороточный (5-10 % сыворотки крови) или асцитичныйагар (25 % асцитичной жидкости).

Триптичнийперевар за Хоттингером. Бульйон из него более экономический чем другие мясо-пептонные среды, поскольку позволяет из одной порции мяса получить в несколько раз больше бульйона. В этой среде содержится большое количество аминокислот, следовательно, повышается его буферність, и за счет этого стабильнее является значение активной реакции среды.

Для изготовления перевара берут один килограмм мяса без сухожилий и жира, порезанный на мелкие куски размером до 1-2 см, окунают в кастрюлю с двойным объемом воды, которая кипит, и кипятят 15-20 мин, пока мясо не станет серым, что свидетельствует о коагуляции белков. Его вынимают из жидкости и пропускают через мясорубку. В жидкости, которая осталась, устанавливают рН 8,0, опускают туда фарш и охлаждают до 40 °С. Потом добавляют 10 % (к объему жидкости) свежей поджелудочной железы, предварительно очищенной от соединительной ткани, жиру и дважды пропускают через мясорубку. Вместо железы используют сухой препарат панкреатина (0,5 %). Полученную смесь тщательным образом взбалтывают и доводят рН до 7,8-8,0. Через 30 мин проверяют рН. Если активная реакция среды не изменяется в кислую сторону, это свидетельствует о недоброкачественности фермента. Когда рН среды стабилизируется, смесь переливают в большие бутыли, заполняя их на 1/3. Добавляют до 3 % хлороформу, закрывают посуду резиновими пробками и интенсивно взбалтывают для перемешивания жидкостей. Избыток паров хлороформа выпускают. Через 1-2 год опять проверяют рН среды, устанавливая его на 7,4-7,6.

Добавить материал

Полученную смесь оставляют при комнатной температуре сроком до 16 дней. В течение первых 3-4 дней ежедневно проверяют и корректируют рН среды, а также взбалтывают флаконы не меньше, чем 3 разы в сутки. Позже эту процедуру можно не проводить и взбалтывать среду следует не так часто. За 1‑2 дня до окончания цикла переваривания взбалтывания среды прекращают.

О завершенном качественном переваривании свидетельствуют просветления жидкости, которая приобретает соломенно-желтый цвет, а также образование на дне пылевидного осадка. Жидкость легко фильтруется, ее проверяют на наличие триптофана с помощью пробы с бромной водой (до 3-4 мл фильтрата добавляют 3-4 капли бромной воды). При наличии триптофана (до 2,0-3,0 г/л) цвет среды изменяется на розово-фиолетовый. Определяют общий азот, который в норме достигает 11,0-12,0 г/л, и аминный азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гидролизат фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, разливают в бутыли и автоклавують при 120 °С в течение 30 мин. В таком виде он может сохраняться длительное время.

Его используют для получения бульйонаХоттингера. С этой целью до 100-200 мл гидролизат у добавляют 800-900 мл дистиллированной воды, 0,5 % хлориду натрия и 0,2 % однозамещенного фосфорнокислого натрия. Доводят рН до 7,4‑7,6, разливают в флаконы и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Мясо-пептоннийагар на основе гидролизат уХоттингера готовят за рецептурой обычного МПА.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает бактериологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

Для культивирования бактерий широко применяют безбелковые среды, в которых хорошо растут много органотрофних, в том числе патогенных видов бактерий. В эти среды входят много компонентов.

Культивирование в синтетических средах с использованием метода меченых атомов дает возможность детальнее дифференцировать бактерии за характером их биосинтеза.

Для дифференциации прототрофних и ауксотрофних бактерий широко используют селективные среды .

Прототрофы растут на минимальной среде, которая содержит только соли и углеводы, поскольку они сами могут синтезировать нужные им для развития метаболиты, тогда как ауксотрофы нуждаются в среде, которая содержит определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.

На густых питательных средах бактерии образуют разные по форме и величине колонии - видимые скопления микроорганизмов одного вида, которые формируются в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, их поверхность - гладкой (S-фор-ми), шершавой (R-формы), исчерченной, бугорчатой, края - ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний также разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, деревовидная. По величине (диаметру) колонии разделяются на большие (4- 5 мм, средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Магниевая среда Раппапорт-Вассилиадис, 500 г/уп, Кат.№ 107700
- Salmonella enrichment broth RAPPAPORT - Магниевая среда Раппапорта, 500 г/уп, Кат.№ 110236
- Tetrathionate enrichment broth Muller-Kauffman - Тетратионатный бульон, 500 г/уп, Кат.№ 110863
- Muller - Kauffmann Tetrathionate - Novobiocin Broth (MKTTn ) - Тетратионатный бульон с новобиоцином, 500 г/уп, Кат.№ 105878
- Bismuth sulfite agar WILSON - BLAIR - Висмут-сульфитный агар, 500 г/уп, Кат.№ 105418
- Hektoen enteric agar - Гектоеновый агар, 500 г/уп, Кат.№ 111681
- SS - agar - Сальмонелла-шигелла агар, 500 г/уп, Кат.№ 107667
- BPLS (Brilliant - green Phenol - red Lactose Sucrose Agar ) - Лактозо-сахарозный агар с бриллиантовым зеленым и феноловым красным, 500 г/уп, Кат.№ 107232
- XLD -агар - Ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий, 500 г/уп, Кат.№ 105287
- XLT4 agar - Ксилозо-лизиновый c тергитолом 4 (полностью ингибирует роста протея), 500 г/уп, Кат.№ 113919
- XLT4 Supplement - Селективная добавка к среде XLT4 агар, 100 мл/уп, Кат.№ 108981
- Rambach agar - Хромогенный Рамбах агар на сальмонеллы на 250 опред., 4 флакона х 250 мл, Кат.№ 107500
- MSRV (Modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis) - Полужидкая среда для ускоренного выделения сальмонелл из продуктов и сырья, 500 г/уп, Кат.№ 109878
- MSRV Selective Supplement - Селективная добавка (новобиоцин, 10 мг) к среде MSRV, 10 флаконов/уп, Кат. № 109874
- Salmosyst broth base - Неселективное обогащение, 500 г/уп, Кат.№ 110153
- Salmosyst selective tablets - Селективное обогащение сальмонелл - тетратионатная среда в таблетках, 250 табл./уп, Кат.№ 110141
- KLIGLER agar - Агар Клиглера, 500 г/л, Кат.№ 103913
- Triple sugar iron agar - Трехсахарный агар с железом, 500 г/уп, Кат.№ 103915
- Lysine iron agar - Лизиновый агар с железом для дифференциации и идентификации энтеробактерий; определение лизиндекарбоксилазы и сероводорода, 500 г/уп, Кат.№ 111640
- SIMMONS citrate agar - Цитратный агар Симмонса для идентификации, 500 г/л, Кат.№ 102501
- Singlepath Salmonella - Экспресс-тест (20 мин) на сальмонеллы, 25 тестов/уп, Кат.№ 104140

Сальмонеллы (Salmonella spp .)
Род сальмонелла относится к семейству Enterobacteriaceae. Бактерии палочковидные, грамотрицательные, аспорогенные, преимущественно подвижные. Во всем мире сальмонелла является одним из наиболее распространенных возбудителей пищевых отравлений, инфицирующих большинство видов сырых продуктов (например, мясо, яйца, растительные продукты). Устойчивость бактерий к высушиванию в сочетании с их высокой термостойкостью создает проблему защиты от патогена большинства сухих и полусухих продуктов. Согласно законодательству в сфере питания большинства стран содержание сальмонеллы не допускается в 25 г пищевого продукта. Для получения простого ответа (да/ нет) о наличии сальмонеллы в пище и кормах при использовании традиционных микробиологических методов необходимо в общей сложности затратить до 5 дней. Для продуктов, нуждающихся в быстрой реализации, это означает значительную задержку. Для удовлетворения требований производителей продуктов питания относительно быстрой реализации готовой продукции и снижения затрат на ее хранение необходимо использовать инновационные ускоренные методы обнаружения сальмонеллы. Таким образом, ускоренные методы анализа сальмонелл вызывают все больший интерес. Экспресс-тесты, предлагаемые для этих целей, должен быть специфичны, чувствительны, удобны и экономически эффективны. В зависимости от количества исследуемых образцов и требований к специфичности метода выбор может быть сделан либо в пользу молекулярного анализа бактериальной ДНК методом ПЦР (как правило, для высокопроизводительной лаборатории), либо в пользу иммунодиагностических тестов (при анализе меньшего количества образцов).

Сальмонеллез
У большинства людей, инфицированных сальмонеллой, развиваться диарея, лихорадка и боли в животе через 12-72 ч после заражения. Болезнь обычно длится 4-7 дней, и большинство пациентов выздоравливают без лечения. Тем не менее, в некоторых случаях заболевание может быть настолько серьезными, что требуется госпитализация. У таких больных сальмонеллезная инфекция может распространиться из кишечника в кровь и другие участки тела. Если больной своевременно не прошел лечение антибиотиками, то это может привести к смерти. Пожилые люди, младенцы и лица с нарушениями иммунной системы будут в первую очередь поражаться наиболее тяжелой формой заболевания.

Патогенность
Сальмонеллы относятся к наиболее опасным возбудителям кишечных инфекций человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ВОЗ в мире каждый год регистрируется до 1,3 млрд. случаев сальмонеллеза, при этом динамика заболевания населения имеет тенденцию к росту. При отсутствии эффективного лечения летальные случаи у людей составляют от 1-3 до 10-15%. Ежегодно в США заболевание регистрируется у 1,4 млн. жителей, а материальные затраты, связанные с последствиями и профилактикой болезни, оценивается в $1-2,3 млрд. В России эта болезнь в структуре острых кишечных инфекций занимает второе место.

Таксономия
Род Salmonella , насчитывающий свыше 2500 сероваров (серотипов), входит в семейство Enterobacteriaceae (энтеробактерий). По современной классификации, основанной на ДНК-анализе, род Salmonella включает патогенный для человека и теплокровных животных вид S. enterica. Этот вид разделен на 6 подвидов. Подвид S. enterica subsp. Enteritidis - возбудитель пищевых токсикоинфекций. Подвиды S. enterica subsp. Typhi, S. enterica subsp. Paratyphi A, B - возбудители у людей брюшного тифа, паратифов А и В.

Морфология
Клетки сальмонеллы - это подвижные (благодаря жгутикам), аспорогенные грамотрицательные прямые палочки (0,5-1х1-3 мкм) с закругленными концами. Встречаются также неподвижные особи и штаммы. Капсулу не образуют, факультативно-анаэробные хемоорганотрофы с окислительным и бродильным метаболизмом. Хорошо растут на простых питательных и желчесодержащих средах. На плотных средах могут образовывать колонии в R-форме (шероховатые) и S-форме (гладкие), на жидких дают диффузное помутнение. Колонии в S-форме средних размеров, блестящие, полупрозрачные, с голубоватым оттенком. При посеве крови лучшими жидкими средами обогащения является желчный бульон, при посеве биоматериалов (фекалии, желчь, моча), содержащих дополнительную флору, селенитовый бульон. На лактозосодержащих дифференциальных средах бактерии образуют бесцветные колонии, на висмут-сульфитном агаре - колонии черного цвета.

Биохимическая характеристика
Сальмонеллы обладают выраженной, характерной для рода биохимической активностью. Для их идентификации важно учитывать следующие биохимические свойства:
1) ферментация глюкозы и других углеводов (маннита, мальтозы) до кислоты и газа (подвид S.t yphi выделяет только кислоту),
2) отсутствие ферментации лактозы, сахарозы, салицина и мочевины,
3) реагируют с метилротом, продуцируют сероводород, индол (как правило) не образуют, - оксидаза отрицательны, каталаза положительны, реакция Фогеса-Проскауэра отрицательна,
4) температурный оптимум для роста - 35-37 о С, рост полностью прекращается при 5 о С; оптимум рН=7,2-7,4.

Согласно серологической классификации подавляющее большинство патогенных для человека сероваров (серотипов) сальмонелл относится к A, B, C, D и E группам. Сальмонеллы типируют по схеме Кауффмана-Уайта в реакции агглютинации. Для ее постановки применяют гипериммунные сыворотки или моноклональные антитела к сальмонеллам. На серотипировании основаны диагностика сальмонеллеза и эпидемиологический анализ возбудителей.

Источники и факторы передачи инфекции
Сальмонеллезы (брюшной тиф, паратифы, гастроэнтериты, септицемия и др.) - широко распространенные пищевые заболевания животных и человека с фекально-оральным механизмом передачи инфекции. У человека пищевые токсикоинфекции сопровождаются поражением желудочно-кишечного тракта и обезвоживанием организма. Заражающая доза от 1000 до 10 тыс. клеток. Постоянная среда обитания - кишечник человека и теплокровных животных, являющихся резервуаром инфекции. Загрязненные пищевые продукты и сырье, а также вода - основные источники и факторы передачи возбудителя. В пищевые продукты патоген переходит из загрязненного сырья. Почва участвует в контактном пути передачи инфекции. Наличие сальмонелл в почве или воде всегда свидетельствует о загрязнении этих сред испражнениями инфицированных людей и/или животных - птиц, крупного рогатого скота, свиней, кошек, собак, голубей. Их инфицированность сальмонеллами колеблется от 6-7 до 80%.

Основные источники инфекции
В США на долю сальмонеллеза приходится около 9% пищевых инфекций, причем значительная часть населения этой страны является его бессимптомными бактерионосителями. Загрязненные птицепродукты, мясо и мясные продукты, молоко, сыр, сливочное масло, овощи и фрукты, полуфабрикаты и приправы (майонез, яичный порошок, кремы и др.) - основные источники сальмонеллеза. Пищевые продукты контаминируются бактериями также в процессе кулинарной обработки, контакта с носителями, производственным оборудованием, животными-переносчиками (мухи, мышевидные грызуны, комнатные животные). Продолжительность жизнеспособности сальмонелл зависит от вида продукции и условий среды обитания. Так, на поверхности овощей и фруктов бактерии выживают в течение 5-10 дней, в молоке - до 20 дней, в пиве и кефире - до 2 месяцев, в колбасных изделиях, мясе (включая соленое), сливочном масле - от 2 до 6 месяцев, в сырах - до 1 года, в замороженном мясе - до 2-3 лет.

Патогенез
Различную природу заболевания объясняют множественностью факторов патогенности (эндо-, экзотоксины и др.), которые еще недостаточно изучены. Все вирулентные сальмонеллы продуцируют эндотоксин, индуцирующий развитие лихорадки у инфицированных людей (с повышением температуры до 39-40 о). После перорального заражения, попав в тонкий кишечник, сальмонеллы инвазируют слизистую кишечника и, размножаясь в макрофагах, формируют первичный очаг инфекции. По окончании инкубационного периода (через 10-14 суток после заражения) попав в кровь, сальмонеллы вызывают бактериемию. Возбудители тифа и паратифа с током крови разносятся по всему организму, оседая в клетках печени, селезенки, легких, костного мозга, а также желчного пузыря. К концу 2-й недели от начала заболевания возбудитель выделяется из организма больного с мочой, испражнениями, материнским молоком, слюной. Иммунитет к заболеванию не формируется.

Методы обнаружения
Важную роль играет специфическая профилактика сальмонеллезов, заключающаяся в проведении ветеринарно-санитарных, санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий. Профилактика сопровождаются перманентным контролем возбудителя в пище, фураже, сырье и воде.

Классический метод

Среды для выделения сальмонелл
- Забуференная пептонная вода
- Среда Раппапорта-Вассилиадиса
- Селенитовая среда
- Тетратионатный бульон
- Ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар
- Бриллиантовый зеленый агар
- Висмут-сульфит агар

Классическая методика исследования сальмонелл с использованием питательных сред. Однако из-за длительности процедуры анализа для определения патогена одного классического метода недостаточно.

Иммунохроматографи-ческие экспресс- тесты
Для ускорения выявления сальмонелл, значительного сокращения трудозатрат и экономии ресурсов в последние десятилетия за рубежом разработаны, испытаны и широко применяются ускоренные методы выявления возбудителя. Ускоренные методы позволяют существенно (на 24-48 ч) сократить продолжительность исследований. Обладая высокой чувствительностью, они обеспечивают надежное выявление сальмонелл в анализируемом материале.

Нормативная документация
- МР 24 ФЦ 976 Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия)
- ГОСТ Р 50455-92. Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный метод)
- ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002). Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella.
- ГОСТ Р 53665-2009. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл;
- СП 3.1.7.2616-10. Санитарно-эпидемические правила. Профилактика сальмонеллеза. М.: Роспотребнадзор. 2010.18 с.

К роду Salmonella относятся возбудитель брюшного тифа S. typhi, паратифов - S. paratyphi A, S. schottmuelleri и возбудители пищевых токсикоинфекций, получивших название сальмонеллезов.

Морфология и тинкториальные свойства. S. typhi, S. paratyphi A, S. schottmuelleri - короткие палочки с закругленными концами, имеют перитрихиальные жгутики, грамотрицательные.

Культивирование и ферментативные свойства. На дифференциально-диагностических средах (Эндо, Левина) образуют прозрачные бесцветные колонии. Сальмонеллы обладают сахаролитическими свойствами: S. typhi ферментирует глюкозу, мальтозу, маннит до кислоты, S. paratyphi и S. schottmuelleri - те. же сахара, но до кислоты и газа, что служит дифференциально-диагностическим признаком. При разложении белков S. typhi и S. schottmuelleri образуется сероводород. Желатин не разжижают.

Антигенная структура и токсинообразование сальмонелл. Сальмонеллы содержат О-антиген-липополисахаридно-протеиновый комплекс, идентичный эндотоксину, Н-антиген и К-антиген - поверхностный, оболочечный, капсульный. Идентификация сальмонелл проводится по антигенным свойствам, согласно классификации, предложенной Кауфманом и Уайтом и построенной по следующему принципу: все сальмонеллы по общности О-антигенов разделены на группы, обозначенные прописными буквами латинского алфавита (А, В, С, D, Е и т. д.); внутри каждой О-группы сальмонеллы подразделяются на серологические варианты на основании различного строения Н-антигенов, обозначенные строчной буквой латинского алфавита и цифрами. В Н-антигенах выделяют две фазы: первую - специфическую и вторую - не специфическую. При идентификации сальмонелл используются диагностические агглютинирующие адсорбированные сыворотки.

Сложная антигенная структура S. typhi включает О-, Н- и Vi-антигены, но такие полноценные в антигенном отношении бактерии выделяются только в разгар заболевания, а в период реконвалесценции и при пересевах в лабораторных условиях Vi-антиген теряется.

Резистентность. Сальмонеллы довольно устойчивы во внешней среде. В зависимости от условий (температура, влажность, инсоляция и др.) они могут сохраняться до года. Дезинфицирующие вещества вызывают гибель сальмонелл в течение нескольких минут, нагревание до 60 °С - через 10-15 мин.

Патогенность для животных. Брюшным тифом и паратифом болеют только люди.

Клинические симптомы заболевания характеризуются постепенным повышением температуры, общим недомоганием, которое переходит в состояние глубокой интоксикации организма, за что заболевание и получило название typhus. Это состояние обусловлено действием эндотоксина, который в разгар заболевания выделяется в больших количествах в результате массовой гибели микробов, чему способствуют образующиеся антитела.

Бактерии с кровью попадают в печень, селезенку, костный мозг, лимфатические узлы тонкой кишки, где размножаются, обогащая кровь возбудителем. Наступает фаза паренхиматозной диффузии. Сальмонеллы, накапливаясь в желчном пузыре в массовом количестве, вторично попадают в тонкую кишку и размножаются в лимфатических образованиях, которые воспаляются, некротизируются, изъязвляются, что может привести к разрушению стенки кишечника, т.е. перфорации - одному из тяжелейших осложнений брюшного тифа. Особенно благоприятные условия для размножения тифозные бактерии находят в желчном пузыре, где они задерживаются наиболее долго и, выделяясь в кишечник, усиливают патологические его поражения. Выделительно-аллергическая фаза выделения микробов - составляет следующий этап патогенеза. Выделяются бактерии из организма не только с испражнениями, но и с мочой, молоком кормящей матери. Выделительная стадия переходит в стадию выздоровления, сопровождающуюся возрастанием титра специфических антител.

Иммунитет. Врожденного иммунитета к инфекциям, вызываемым возбудителями брюшного тифа и паратифов, не существует. Перенесенное заболевание оставляет прочный иммунитет и случаи повторного заболевания редки. Однако возможны рецидивы, а переболевшие брюшным тифом становятся хроническими бактерионосителями.

Лабораторная диагностика сальмонелл. При диагностике учитываются эпидемиологические данные и клинические симптомы. С первого дня заболевания необходимо исследовать кровь. Метод гемокультуры является решающим и ранним методом. Наилучшей элективной питательной средой служит среда с желчью, нейтрализующая антитела, бактерицидные свойства сыворотки крови. Можно выделять культуру возбудителя из костного мозга, мочи, розеол, но эти методы применяются редко. В период реконвалесценции выделяют возбудителя из испражнений. Выделенные культуры идентифицируются по биохимическим и антигенным свойствам.

При определении вида сальмонелл сначала ставится реакция агглютинации с поливалентной сывороткой, дающей возможность определить принадлежность выделенной культуры к роду сальмонелл, затем определяется группа с помощью отдельных групповых адсорбированных сывороток, а затем и вид сальмонелл - в реакции агглютинации с монореценторными специфическими Н-сыворотками.

Исследование сыворотки больных может проводиться в первые дни заболевания обнаружением неполных антител с помощью реакции Кумбса и с 4-5-го дня - полных антител в реакции Видаля, которую ставят повторно через несколько дней с целью определения нарастания титра антител. Однако наряду с преимуществами постановки реакции Видаля (простота реакции, получение быстрого ответа, возможность ретроспективного диагноза) метод имеет и недостатки: не является ранним, антитела могут быть и у переболевшего (анамнестическая реакция) и у привитого («прививочный Видаль»). Нужно учитывать и тот факт, что Н-антитела сохраняются длительно, а О-антитела исчезают из крови переболевшего довольно быстро.

С целью обнаружения антител в сыворотках крови больных брюшным тифом применяется реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Большую трудность представляет выявление бактерионосителей. Бактериологические исследования, носящие массовый характер при периодических обследованиях работников пищевых предприятий и детских учреждений, занимают много времени и не всегда результативны, так как даже от заведомо известного носителя трудно бывает выделить микроб. В настоящее время для обнаружения носителя широко используют серологический метод-реакцию Vi-гемагглютинации с сывороткой носителя. Vi-антиген по химической природе является полисахаридом, его извлекают в чистом виде и адсорбируют на поверхности эритроцитов 0 группы крови человека. Сыворотка носителя вызывает реакцию гемагглютинации при взаимодействии с Vi-эритроцитарным диагностикумом. У носителя реакция положительна в небольших разведениях. Выявленные реакцией Vi-гемагглютинации носители обследуются бактериологическими методами (выделение культуры из испражнений, дуоденального содержимого).

При необходимости для эпидемиологической расшифровки заболеваний проводится дифференцирование выделенных культур с помощью Vi-бактериофагов, обладающих строгой типоспецифичностью. При фаготипировании используется 78 типов Vi-бактериофагов, с помощью которых выявляется такое же количество фаготипов этих бактерий. Метод фаготипирования дает возможность устанавливать или исключать предполагаемые источники инфекции, прослеживать эпидемиологические связи, отличать местные случаи от «привозных» и спорадические заболевания от эпидемических.

Эпидемиология сальмонелл. Источником и резервуаром инфекции является только человек: больной или носитель. Механизм передачи фекально-оральный, пути распространения - при непосредственном контакте, с инфицированной пищей (молоко), водой, зараженной сточными водами. При сравнительно низкой заболеваемости в настоящее время основное значение имеет контактно-бытовой путь передачи - через загрязненные руки, посуду, белье и т. п. Заболеваемость характеризуется летне-осенней сезонностью.

Специфическое лечение и профилактика. Для лечения больных применяются антибиотики широкого спектра действия, группа тетрациклина, левомицетин. Антибиотикотерапия, однако, не предупреждает рецидивы и длительное бактерионосительство. Советские и зарубежные исследователи, изучая механизм действия антибиотиков в клинических условиях, обратили внимание на то, что их эффективность тесно связана со степенью развития специфического иммунитета. Поэтому, кроме антибиотиков, рекомендуют проводить лечение средствами, которые специфически стимулируют иммуногенез (корпускулярная вакцина, парциальные антигены). При комплексной иммуноантибиотикотерапии (антибиотики и раздельно моновакцина и Vi-антиген) у больных брюшным тифом значительно сокращается частота рецидивов, отсутствует формирование бактерионосительства.

С целью профилактики применяются брюшнотифозная спиртовая вакцина, обогащенная Vi-антигеном (по эпидемическим показаниям). Для иммунизации военнослужащих используется химическая сорбированная тифозно-паратифозно-столбнячная вакцина (TABle), coдержащая выделенные из брюшнотифозных, паратифозных А и В бактерий комплексные антигены и очищенный столбнячный анатоксин.

Идентификация сальмонелл

После 18-20 часового инкубирования чашек с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар 48 час.) производится учет характера роста с отбором 3-5 подозрительных колоний на одну из сред для первичной идентификации (Клиглера, Ресселя, Олькеницкого) и на скошенный питательный агар. В случае чрезвычайной эпидемической ситуации культуру, выросшую на указанных средах, используют для последующей постановки реакции агглютинации. Результаты этой реакции ориентировочны и требуют подтверждения на этапе завершения биохимической идентификации.

Культуральные свойства

Общность морфологии и ряда культуральных свойств бактерий рода Salmonella не позволяет типизировать их по указанным признакам. Для этого кроме морфологии и культуральных свойств изучают ферментативные свойства и антигенную структуру, в отдельных случаях ставят биологическую пробу на лабораторных животных.

Ферментативные свойства бактерий обусловлены набором ферментов, отражают определенные условия питания и обмена веществ, свойственные данному виду микроорганизмов в тех или иных условиях внешней среды. Бактерии рода Salmonella характеризуются следующими ферментативными свойствами: не разжижают желатина, не разлагают адонита и не ферментируют сахарозу; подавляющее большинство не расщепляет салицина и не разлагает лактозу, не образует индола, не расщепляет мочевину, не дает реакции Фогес-Проскауера (реакция на ацетилметилкарбинол); ферментирует (за небольшим исключением мальтозу, маннит, сорбит, расщепляет глюкозу с образованием газа (S. typhi, S. pullorum обычно не образуют газа); дает положительную реакцию с метиловым красным, утилизирует аммоний и редуцирует нитраты; большинство из них продуцирует сероводород.

Для изучения ферментативных свойств бактерий рода Salmonella обычно используют короткий цветной (пестрый) ряд, состоящий из сред с глюкозой, маннитом, арабинозой, дульцитом, рамнозой (среда Биттера); глицеринофуксиновый бульон (бульон Штерна). Помимо указанных сред для дифференциации серологических типов сальмонелл используют также среды с мальтозой, инозитом, трегалозой, ксилозой; лакмусовое молоко (изменение лакмусового молока при росте сальмонелл позволяет их дифференцировать по способности образовывать кислоту или щелочь). Вместо лакмусового можно использовать обезжиренное молоко с индикатором бромтимоловым синим (1 мл 0,4%-ного раствора в 100 мл молока). Известное значение для дифференциации сальмонелл имеет образование сероводорода культурой. Протеоли-тические свойства исследуют путем посева изучаемой культуры сальмонелл на МПЖ и молоко.

Ввиду сходства бактерий рода Salmonella с другими микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae возникает необходимость их дифференциации. В настоящее время в бактериологической практике широко используют плотные дифференциально-диагностические питательные среды с лактозой (среды Плоскирева, Эндо, Левина). По способности бактерий ферментировать лактозу сальмонеллы отличают от часто сопутствующей Е. сoli, поэтому при исследовании материала на сальмонеллы вначале производят высев на одну из дифференциально-диагностических сред. На этих средах Е. coli, ферментирующая лактозу с образованием кислоты и изменением цвета индикатора, образует колонии, отличающиеся по цвету от колоний сальмонелл, не ферментирующих лактозу. На среде Эндо бактерии Е. coli дают колонии красного цвета, часто с металлическим блеском, сальмонеллы -- бесцветные или бледно-розовые (окрашенные в цвет среды); на среде Плоскирева Е. coli -- колонии оранжево-красного цвета, сальмонеллы -- прозрачные или нежно-розовые; на среде Левина Е.- coli формируют колонии черного цвета, окруженные ободком, сальмонеллы-- прозрачные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые. Для дифференциации сальмонелл и культурально сходных штаммов, а также бактерий рода Proteus и бактерий группы кишечных палочек применяют среды с мочевиной (среда Прейса, Ресселя, Олькеницкого), SS-агар (Salmonella -- Shigella -- агар) и др. Цвет этих сред обусловлен неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ с образованием щелочных продуктов. Бактерии группы кишечных палочек и Proteus (за исключением 0-формы), как правило, на SS-aгape не дают роста, а сальмонеллы растут в виде нежных, бесцветных колоний.

Плотные дифференциально-диагностические среды служат лишь для определения принадлежности бактерий к роду Salmonella и отделения их от сопутствующей микрофлоры.

Ферментативные свойства сальмонелл не всегда стабильны и могут изменяться в зависимости от условий внешней среды, поэтому правильное типизирование сальмонелл возможно лишь в результате изучения комплекса морфологических, культуральных, ферментативных свойств и антигенной структуры