I. Культуры клеток

1966 г.).

Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток. В 1954 г. Эндерс , Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». В 1952 г. была получена широко известная линия раковых клеток человека HeLa .

Основные принципы культивирования [ | ]

Выделение клеток [ | ]

Культуры клеток, взятых непосредственно от объекта (ex vivo), называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки такие стареют и прекращают делиться, хотя могут при этом сохранить жизнеспособность.

Существуют иммортализованные («бессмертные») линии клеток, способные размножаться бесконечно. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации , но у некоторых лабораторных клеточных линий она приобретена искусственно, путём активации гена теломеразы .

Культивирование клеток [ | ]

Клетки выращивают в специальных питательных средах , при постоянной температуре. Для культур растительных клеток используется регулируемое освещение, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур . Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, , концентрации глюкозы , составу факторов роста и др . Факторы роста , используемые в питательных средах для клеток млекопитающих, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови . Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингредиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Наилучшим, но и наиболее дорогостоящим способом является добавление вместо сыворотки очищенных факторов роста .

Перекрёстное загрязнение клеточных линий [ | ]

При работе с клеточными культурами учёные могут столкнуться с проблемой перекрёстного загрязнения.

Особенности выращивания клеток [ | ]

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре, и, как следствие, возникают следующие проблемы:

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, ирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами , или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты (амфотерицин B).

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия .

Гибридома [ | ]

Использование клеточных культур [ | ]

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии .

Продукты биотехнологии [ | ]

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины , противоопухолевые препараты . Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .

Тканевые культуры [ | ]

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .

Вакцины [ | ]

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого штаммом вируса H5N1 , в настоящий момент правительство Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против птичьего гриппа с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих [ | ]

Культуры клеток растений [ | ]

Культуры клеток растений, как правило, выращиваются либо в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо в виде каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определенного баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов .

Бактериальные, дрожжевые культуры [ | ]

Основная статья:

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара . Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры [ | ]

В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:

- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.

- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.

- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на

1) первичные (первично трипсинизированные),

2) полуперевиваемые (диплоидные)

3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.

По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования . В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.

Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования

Зачатков органов, выращенные вне организма (in vitro). В основе выращивания клеток и тканей лежит строгое соблюдение стерильности и использование специальных питательных сред, обеспечивающих поддержание жизнедеятельности культивируемых клеток и максимально сходных со средой, с которой клетки взаимодействуют в организме. Метод получения культуры клеток и тканей является одним из важнейших в экспериментальной биологии. Культуры клеток и тканей могут быть заморожены и сохраняться длительное время при температуре жидкого азота (-196°С). Основополагающий эксперимент по культивированию клеток животных провёл американский учёный Р. Гаррисон в 1907 году, поместив кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки в сгусток лимфы. Клетки зачатка оставались живыми несколько недель, из них вырастали нервные волокна. Со временем метод был усовершенствован А. Каррелем (Франция), М. Берроузом (США), А. А. Максимовым (Россия) и другими учёными, использовавшими в качестве питательной среды плазму крови и вытяжку из тканей зародыша. В дальнейшем успехи в получении культуры клеток и тканей были связаны с разработкой сред определённого химического состава для культивирования различных типов клеток. Обычно они содержат соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, факторы роста, антибиотики, предупреждающие заражение культуры бактериями и микроскопическими грибами. Начало созданию метода культуры клеток и тканей у растений (на кусочке флоэмы моркови) положено Ф. Стюардом (США) в 1958.

Для культивирования клеток животных и человека могут быть использованы клетки разного происхождения: эпителиальные (печень, лёгкие, молочная железа, кожа, мочевой пузырь, почка), соединительнотканные (фибробласты), скелетные (кость и хрящи), мышечные (скелетные, сердечная и гладкие мышцы), нервной системы (глиальные клетки и нейроны), железистые клетки, секретирующие гормоны (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и различные типы опухолевых клеток. Выделяют 2 направления их культивирования: культура клеток и органная культура (культура органов и тканей). Для получения культуры клеток - генетически однородной быстро пролиферирующей популяции - кусочки ткани (обычно около 1 мм 3) извлекают из организма, обрабатывают соответствующими ферментами (для разрушения межклеточных контактов) и образующуюся суспензию помещают в питательную среду. Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом (из-за низкого уровня дифференцировки и наличия стволовых клеток-предшественников в эмбрионах) по сравнению с соответствующими тканями, взятыми из взрослого организма. Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни (так называемый предел Хейфлика), тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время. Однако даже в культуре нормальных клеток некоторые клетки спонтанно иммортализуются, то есть становятся бессмертными. Они выживают и дают начало клеточным линиям с неограниченным сроком жизни. Исходно клеточная линия может быть получена из популяции клеток или из отдельной клетки. В последнем случае линию называют клоновой, или клоном. При длительном культивировании под воздействием различных факторов свойства нормальных клеток изменяются, происходит трансформация, основными признаками которой являются нарушения морфологии клеток, изменение числа хромосом (анеуплоидия). При высокой степени трансформации введение таких клеток животному может вызывать образование опухоли. В органной культуре сохраняются структурная организация ткани, межклеточные взаимодействия, поддерживается гистологическая и биохимическая дифференцировка. Ткани, зависимые от гормонов, сохраняют чувствительность к ним и характерные ответы, железистые клетки продолжают секретировать специфические гормоны и т.д. Такие культуры выращивают в культуральном сосуде на плотиках (бумажных, миллипоровых) или на металлической сетке, плавающих на поверхности питательной среды.

У растений культивирование клеток основано, в общем, на тех же принципах, что и у животных. Различия же в способах культивирования определяются структурными и биологическими особенностями клеток растений. Большинство клеток растительных тканей обладают тотипотентностью: из одной такой клетки при определённых условиях может развиться полноценное растение. Для получения культуры растительных клеток используется кусочек любой ткани (например, каллуса) или органа (корня, стебля, листа), в котором присутствуют живые клетки. Его помещают на питательную среду, содержащую минеральные соли, витамины, углеводы и фитогормоны (чаще всего цитокины и ауксины). Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27°С, в темноте или при освещении.

Культуры клеток и тканей находят широкое применение в разных областях биологии и медицины. Культивирование соматических клеток (все клетки органов и тканей за исключением половых) вне организма определило возможность развития новых способов изучения генетики высших организмов с использованием, наряду с методами классической генетики, методов молекулярной биологии. Наибольшее развитие получила молекулярная генетика соматических клеток млекопитающих, что связано с появившейся возможностью постановки прямых экспериментов с клетками человека. Культуру клеток и тканей используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов экспрессии генов, раннего эмбрионального развития, дифференцировки и пролиферации, взаимодействия ядра и цитоплазмы, клеток со средой, адаптации к различным химическим и физическим воздействиям, старения, злокачественной трансформации и др., её применяют для диагностики и лечения наследственных заболеваний. В качестве тест-объектов клеточные культуры являются альтернативой использованию животных при испытании новых фармакологических средств. Они необходимы при получении трансгенных растений, клонального размножения. Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии при создании гибридов, производстве вакцин и биологически активных веществ.

Смотри также Клеточная инженерия.

Лит.: Методы культивирования клеток. Л., 1988; Культура животных клеток. Методы / Под редакцией Р. Фрешни. М., 1989; Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991; Freshney R. I. Culture of animal cells: а manual of basic technique. 5th ed. Hoboken, 2005.

О. П. Кисурина-Евгеньева.

Клеточная культура

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор , содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней . Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток.

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей. Клетки, взятые непосредственно от объекта, называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки подвергаются процессу старения и прекращают делиться, но жизнеспособность не утрачивают. Существуют «бессмертные» линии клеток, способные размножаться бесконечно. Эта способность является результатом случайной мутации , либо приобретена искусственно, с помощью подавления гена теломеразы .

Выращивание клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре и в специальной газовой среде в инкубаторе клеточных культур . Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др . Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего получают из крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингридиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Клетки можно выращивать в суспензии , либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно измененных таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности, это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения сцепных свойств, и для стимулирования роста и дифференцирования. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяется органотипический тип культуры клеток, который представляет собой трехмерную среду, в отличие от от обычной лабораторной посуды. Этот система культивирования физически и биохимически наиболее схожа с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии).

Перекрестное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами ученые могут столкнуться с проблемой перекрестного загрязнения. Судя по результатам исследований, можно предположить, что в 15-20 % случаев клетки, используемые в экспериментах были испорчены, или были загрязнены клетками других клеточных линий .

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы:

Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).

Линии клеток человека

Одна из самых ранних культур клеток человека, полученная от Генриетты Лакс, которая умерла от рака шейки матки. Культура клеток ядра окрашены в синий цвет.

Линия клеток «Гибридома»

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .

Тканевые культуры

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против

Клеточные культуры

Технология клеточных культур заключается в выращивании клеток вне живых организмов.

Культуры растительных клеток

Культуры растительных клеток не только являются важным этапом создания трансгенных растений, но и экологически приемлемым и экономически оправданым источником природных продуктов, обладающих терапевтическими свойствами, как, например, паклитаксель (paclitaxel), содержащийся в тисовой древесине и выпускаемый как препарат для химиотерапии под названием Таксол (Taxol). Культуры растительных клеток также применяются для производства веществ, используемых пищевой промышленностью в качестве ароматизаторов и красителей.

Культуры клеток насекомых

Изучение и применение культур клеток насекомых расширяет возможности разработки и использования человеком биологических агентов, уничтожающих насекомых-вредителей, но не влияющих на жизнеспособность полезных насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Несмотря на то, что достоинства биологических методов борьбы с вредителями были известны уже давно, производство таких биологически активных веществ и патогенных для насекомых и микроорганизмов в промышленных количествах очень затруднено. Использование культур клеток насекомых способно полностью решить эту проблему. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Эта перспектива в настоящее время активно изучается. Кроме того, изучается возможность использования клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP – virus-like particle – вирусоподобные частицы) для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца.

Культуры клеток млекопитающих

Клеточные культуры млекопитающих являются одним из главных инструментов, используемых специалистами племенного животноводства в течение уже не одного десятилетия. В лабораторных условиях яйцеклетки, полученные от коров, обладающих выдающимися качествами, оплодотворяются сперматозоидами соответствующих быков. Образующиеся при этом эмбрионы в течение нескольких дней выращиваются в пробирке, после чего имплантируются в матки суррогатных коров-матерей. Этот же прием является основой экстракорпорального оплодотворения человека.

В настоящее время использование культур клеток млекопитающих выходит далеко за рамки искусственного оплодотворения. Клетки млекопитающих могут дополнять, а возможно, когда-нибудь и заменят использование животных для тестирования безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме того, так же как клетки растений и насекомых, клетки млекопитающих могут быть использованы для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Например, моноклональные антитела синтезируются именно культурами клеток млекопитающих.

Ученые также рассматривают возможность использования клеток млекопитающих для производства вакцин. В 2005 году Министерство здравоохранения и социальных услуг США заключило с компанией Sanofi Pasteur контракт на 97 миллионов долларов США. Задачей специалистов компании является разработка методик культивирования клеток млекопитающих с целью ускорения процесса разработки вакцин против гриппа и, соответственно, повышения готовности человечества к пандемии.

Методы терапии, основанные на использовании культур взрослых стволовых клеток , обнаруженных в некоторых тканях организма (костном мозге, жировой ткани, мозге и др.), также скоро займут достойное место в клинической практике. Исследователи установили, что стволовые клетки могут быть использованы организмом для восстановления поврежденных тканей. Взрослые гемопоэтические стволовые клетки уже давно используются в качестве трансплантатов костного мозга. Они необходимы для восстановления процессов созревания и формирования всех типов клеток крови. Такие клетки могут быть в больших количествах получены из пуповинной крови, однако их выделение является довольно сложным процессом.

В настоящее время исследователи работают над методами выделения стволовых клеток из плаценты и жировой ткани. Ряд специалистов занят разработкой методов клеточного ре-программирования – возвращения в недифференцированное состояние зрелых клеток организма, например, клеток кожи, и последующей стимуляции их дифференцирования в клетки необходимого типа ткани.

Эмбриональные стволовые клетки

Использование эмбриональных стволовых клеток также рассматривается в качестве потенциального метода терапии многих заболеваний. Как понятно из названия, эмбриональные клетки получают из эмбрионов, в частности, тех, что развиваются из яйцеклеток, оплодотворенных in vitro (в клиниках, занимающихся экстракорпоральным оплодотворением) и, с согласия доноров, переданных исследователям для использования в научных целях. Обычно используются бластоцисты – 4-5-дневные эмбрионы, выглядящие под микроскопом как шарики, состоящие из нескольких сотен клеток.

Для выделения человеческих эмбриональных стволовых клеток внутренняя клеточная масса бластоцисты переносится в богатую питательными веществами культуральную среду, где клетки начинают активно делиться. В течение нескольких дней клетки покрывают всю поверхность культуральной плашки. После этого исследователи собирают делящиеся клетки, делят их на части и помещают в новые плашки. Процесс перемещения клеток в новые плашки называется пересевом и может многократно повторяться в течение многих месяцев. Цикл пересева клеток называется пассаж . Эмбриональные стволовые клетки, просуществовавшие в культуре в течение шести и более месяцев без дифференцировки (т.е. остающиеся плюрипотентными – способными дифференцироваться в клетки любой ткани организма) и сохранившие нормальный набор генов, называются линией эмбриональных стволовых клеток .

Внутренняя поверхность культуральной плашки зачастую покрывается клетками кожи мышиных зародышей, генетически модифицированных на неспособность к делению. Эти клетки образуют фидерный слой – «питательную подложку», благодаря которой эмбриональные клетки прикрепляются к поверхности. Ученые пытаются усовершенствовать существующий метод и исключить необходимость использования мышиных клеток, так как их присутствие всегда привносит риск попадания в культуру человеческих клеток вирусных частиц и мышиных белков, способных вызвать аллергическую реакцию.

Максимальная ценность терапии с использованием стволовых клеток и тканевой инженерии может быть достигнута в том случае, если терапевтические стволовые клетки и ткани, выращенные из них, являются генетически идентичными клеткам реципиента. Поэтому, если сам пациент не является их источником, стволовые клетки должны быть модифицированы методом замещения их генетического материала генами реципиента и только потом дифференцированы в клетки специфического типа. На настоящее время процедура замещения генетического материала и ре-программирования может быть успешно проделана только с эмбриональными стволовыми клетками.