Какую функцию выполняют транспортные рнк. Как строение трнк связано с ее функциями
Молекулы РНК в отличие от ДНК построены из одной полинуклеотидной цепи. Однако в этой цепи (для рРНК и мРНК) имеются комплементарные друг другу участки, которые могут взаимодействовать, образуя двойные спирали. При этом соединяются водородными связями нуклеотидные пары А-У и Г-Ц. Такие спирализованные участки (их называют шпильками) обычно содержат небольшое количество нуклеотидных пар (до 20-30) и чередуются с неспирализованными участками.
Характерную вторичную структуру имеют тРНК. Они содержат четыре спирализованных участка и три (четыре) одноцепочные петли. При изображении такой структуры на плоскости получается фигура, называемая «клеверным листом» (рис. справа).
Рис.. Вторичная (справа) и третичная (слева) структура тРНК
Все несколько десятков разных тРНК клетки имеют общий план пространственной структуры, но различаются в деталях. В тРНК выделяют следующие структурные участки.
1. Акцепторный конец - во всех типах тРНК имеет состав ЦЦА. К гидроксилу З"-ОН аденозина карбоксильной группой присоединяется аминокислота, которую данная тРНК доставляет к рибосомам, где происходит синтез белка.
2. Антикодоновая петля - содержит специфический для каждой тРНК триплет нуклеотидов (антикодоны). Антикодон комплементарен кодону мРНК. Кодон-антикодоновое взаимодействие определяет порядок чередования аминокислот в белковой молекуле при синтезе ее на рибосомах.
3. Псевдоуридиловая петля (Г,С) - участвует в связывании тРНК с рибосомой.
4. Дигидроуридиловая (D) петля необходима для связывания с ферментом аминоацил-тРНК-синтетзой, которая участвует в узнавании аминокислотой своей тРНК.
5. Добавочная петля - разная у разных тРНК.
Третичная структура рнк и днк
Пространственная конфигурация спирализованной полинуклеотидной цепи (третичная структура) достаточно полно выяснена для молекул РНК. Установлено, что нативные молекулы тРНК имеют примерно одинаковую третичную структуру, которая отличается от плоской структуры «клеверного листа» (вторичная структура) большей компактностью за счет складывания различных частей молекулы (см. рис выше).
Для рРНК и мРНК возможно существование, а зависимости от концентрации солей и температуры, трех видов третичной структуры (рис. ниже). Первый - рыхлый беспорядочный клубок или распрямленная цепь (при повышении температуры и отсутствии солей). Второй вариант - компактный клубок с двуспиральными участками (высокая ионная сила, комнатная температура). Третий вид - компактная палочка с упорядочение ориентированными двуспиральными участками (низкая ионная сила, комнатная температура). Все три типа третичной структуры РНК связаны взаимными переходами.
Третичная структура ДНК зависит от того, сколько цепочек полинуклеотидов (одна или две) в ДНК. В ряде вирусов обнаружены одноцепочечные ДНК линейной и кольцевой формы. Двуцепочечные спиралевидные молекулы ДНК также могут существовать в линейной и кольцевой форме; образование последней вызвано ковалентным соединением их открытых концов.
Рис. Третичная структура: А - ДНК: 1 - линейная одноцепочечная бактериофаг ФХ174 (и др. вирусов); 2 - кольцевая одноцепочечная ДНК вирусов и митохондрий; 3 - кольцевая двойная спираль ДНК; Б - РНК: 1 - рыхлый клубок или распрямленная цепь; 2 - компактная палочка; 3 - компактный клубок
Кроме того, полагают, что биспиральные молекулы ДНК существуют в хромосомах в виде вторично спирализованных фрагментов, связанных друг с другом (суперспираль). Поэтому молекулярный вес нативной ДНК достигает нескольких сотен миллионов. Следовательно, молекулы с молекулярной массой 10.000.000 являются субъединицами более крупных молекулярных образований (третичная структура). Именно суперспирализация обеспечивает экономную упаковку огромной молекулы ДНК в хромосоме: вместо 8 см длины, которую она могла бы иметь в вытянутой форме, она занимает всего 5 нм.
Данная статья является второй в серии автопубликаций, которую необходимо читать после ознакомления с первой статьёй Свойства генетического кода - след его возникновения . Крайне желательным для людей, плохо знакомым с основами молекулярной биологии, знакомство со статьёй О.О. Фаворовой " ". Важно понимать, для того, чтобы понять КАК возник генетический код , необходимо понять, КАК он функционирует в современных организмах. А для этого необходимо вникнуть в молекулярные механизмы кодируемого синтеза белка. Для понимания данной статьи важно понимать, как устроена молекула РНК, чем она отличается от молекулы ДНК.
Разобраться в теме о происхождении жизни вообще, и возникновении генетического кода, в частности, просто невозможно без понимания основных молекулярных механизмов в живых организмах, в первую очередь двух аспектов - воспроизведения наследственных молекул (нуклеиновых кислот) и синтеза белка. Поэтому данная статья посвящена в первую очередь изложению того минимума знания, с помощью которого можно понять богатый и довольно интересный материал, связанный с происхождением генетического кода (ГК).
Знакомство с молекулярными механизмами синтеза белка лучше всего начинать с изучения структуры одного из ключевых компонентов и одной из самых древних структур в живых организмах - молекулы транспортной РНК (или тРНК ). Молекула тРНК имеет необычайно консервативную структуру, которая сходна у всех живых организмах. Эта структура меняется в ходе эволюции настолько медленно, что позволяет нам извлечь немало информации о том, как могли выглядеть древнейшие белок-синтезирующие системы в период их начального формирования. Поэтому говорят, что молекула тРНК является молекулярным реликтом.
Молекулярный реликт , или молекулярное ископаемое - это абстракция, обозначающая древние механизмы и молекулярные и надмолекулярные структуры, встречающиеся в современных организмах, что позволяет нам извлекать информацию об устройстве древнейших живых систем. К молекулярным реликтам относятся молекулы рибосомной и транспортных РНК, аминоацил-тРНК -синтетаз, ДНК- и РНК-полимераз и сам генетический код , как способ кодирования, а также ряд других молекулярных структур и механизмов. Их анализ и является ключевым источником информации о том, как могла возникнуть жизнь, и генетический код , в частности. Рассмотрим подробнее структуру тРНК и те её участки, которые изменяются в ходе эволюции настолько медленно, что ещё содержат немало информации относительно древних тРНК , существовавших более 3,5 млрд. лет назад.
Молекула тРНК относительно небольшая, её длина варьирует от 74 до 95 нукелотидных остатков, наиболее часто - 76 нуклеотидов (см. рис. 1). В последовательности тРНК выделяют так называемые консервативные нуклеотидные остатки - это нуклеотидные остатки расположенные в строго определённых последовательностях почти у всех молекул тРНК . Кроме того выделяются полуконсервативные нуклеотидные остатки - это остатки, представленные только пуриновыми или пиримидиновыми основаниямив строго определённых последовательностях тРНК . Кроме того, различные участки тРНК изменяются с существенно различной скоростью.
До 25% всех нуклеотидных остатков представлены модифицированными нуклеозидами, часто называемых минорными . Минорных остатков описано уже больше 60. Они образуются врезультате модификации обычных нуклеозидных остатков с помощью специальных ферментов.
Среди модифицированных остатков часто встречаются псевдоуридин (5-рибофуранозилурацил, Ψ), 5,6- дигидроуридин (D ), 4-тиоуридил и инозин. Структура некоторых модифицированный оснований и частично их роль изложены в статье
Наряду с первичной структурой (это просто последовательность нуклеотидов), молекула тРНК обладает вторичной и третичной структурой.
Вторичная структура обусловлена образованием водородных связей между нуклеотидами. Ещё в школе учат про водородные связи при комплементарным спариванием между нуклеотидами (A-U и G-C такой вид спаривания нуклеотидов называют каноническим), но в молекулах тРНК также образуется немалое количество неканонических связей, в частности, между G и U, которые будет несколько слабее и энергетически менее выгодная ).
Рис. 1. Обобщённая вторичная структура тРНК (слева) и общепринятая нумерация нуклеотидов в тРНК (справа). Так она выглядит почти у всех живых организмов. На правом рисунке консервативные нуклеотиды выделены жирными кружочками.
Обозначения: N - любой нуклеотид, Т - тимин, D - дигидроуридин, Ψ - псевдоуридин, R - пуриновый нуклеотид.
В результате образуется так называемая структура клеверного листа. В структуре клеверного листа выделяют: акцепторный стебель и три ветви, или домена (arms ): антикокодоновую (состоит из антикодонового двуцепочечного стебля (stem ) и антикодоновой петли (loop ), дигидроуридиновую, или D -ветвь, или D -домен, (также из дигидроуридиновой петли и стебля) и TΨC -ветви, или просто Т-ветви, или Т-домена, (Т-петли и Т-стебля). В дополнение к трём петлям клеверного листа выделяется также так называемая дополнительная, или вариабельная, петля. Длина вариабельной петли варьирует от4 до 24 нуклеотидов.
Почему вторичная структура тРНК имеет Фому клеверного листа? Ответ на этот вопрос дал М.Эйген [Эйген М, Винклер Р. 1979] . Дело в том, что при длине РНКовой цепи 80 нуклеотидов со случайной последовательностью вторичная структура с 3-4 лепестками является наиболее вероятной. Хотя шпилька, имеющая только одну петлю имеет максимальное число спаренныхоснований, эта стуктура в случайных последовательностях является маловероятной. Именно поэтому разумно считать, что тРНК -подобные структуры (то есть структуры с 3-4 петлями) были наиболее распространёнными молекулами на стадии РНКовой и РНК-белковой жизни. Дополнительные доводы в пользу этого утверждения будут приведены в следующих статьях.
Третичная стуктура тРНК .
Третичная структура тРНК соответстует реальной пространственной структуре. Она получила название L -формы, из-за сходства третичной структуры с формой латинской заглавной буквы « L ». Третичная структура образуется благодаря взаимодействию элементов вторичной структуры. Веё формировании принимают участие стэкинг-взаимодействия оснований. За счёт стэкинга оснований акцепторный и Т-стебель клеверного листа образуют одну непрерывную двойную спираль, формирующую одну из «палочек» L -формы. Антикодоновый и D -стебли образуют другую «палочку» этой буквы, D - и T -петли оказываются в такой структуре сближенными и скрепляются между собой путём образования дополнительных, часто необычных пар оснований, которые, как правило, образованы консервативными или полуконсервативными остатками. В свете такого участия консервативных и полуконсервативных оснований в образовании L -формы становится ясным их присутствие в T - и D -петлях. Формирование L-образной структуры и её взаимодействие с АРСаз ой схематически приведено на рис. 2.
Рис. 2. Схема образования пространственной L -образной стуктуры тРНК и взаимодействия её с АРСаз ой.
Стрелкой обозначено место присоединения аминокислоты при аминоацилировании тРНК синтетазой. Красным цветом выделен акцепторный домен тРНК , синим - антикодоновый домен. Овалами обозначены домены АРСаз ы: зелёный - каталитический домен, содержащий домен связывания и аминоацилирования акцепторной области тРНК , жёлтым и оранжевым - вариабельныйдомен АРСаз ы. В зависимости от размера этого домена, АРСаз а распознаёт вариабельным доменом антикодоновую область (домен обозначен жёлтым цветом), или не распознаёт (домен обозначен оранжевым цветом).
Основания антикодона обращены внутрь L -образной молекулы.
Транспортные РНК во всех живых организмах последовательно выполняют три фукнции, необходимые для осуществления синтеза белка:
1) акцепторную - с помощью белковых ферментов (аминоацил-тРНК -синтатаз) ковалентно присоединяет к аминоацильному остатку строго определённую аминокислоту (для каждой аминокислоты - строго своя одна или иногда несколько разных тРНК ); 2) транспортную - транспортирует аминокислоту к специфическому месту на рибосоме; 3) адапторную - в комплексе с рибосомой способен специфически узнавать триплет генетического кода на матричной РНК, после чего присоединённая к тРНК аминокислота включается в растущую полипептидную цепь на рибосоме.
Статьи, связанные с темой:
Строение транспортных РНК и их функция на первом (предрибосомном) этапе биосинтеза белков
Синтез предшественников рРНК и тРНК сходен с синтезом ире-мРНК. Первичный транскрипт рибосомных РНК не содержит интронов, и при действии специфических РНКаз расщепляется с образованием 28S-, 18S- и 5,8S-pPHK; 5S-pPHK синтезируется при участии РНК-полимеразы III.
рРНК и тРНК.
Первичные транскрипты тРНК превращаются в зрелые формы также путем частичного гидролиза.
Все типы РНК участвуют в биосинтезе белков, но их функции в этом процессе различны. Роль матрицы, определяющей первичную структуру белков, выполняют матричные РНК (мРНК).Важное значение для изучения механизмов трансляции имеет использование бесклеточных систем биосинтеза белков. Если инкубировать гомогенаты тканей со смесью аминокислот, из которых хотя бы одна меченая, то по включению метки в белки можно регистрировать биосинтез белков. Первичная структура синтезируемого белка определяется первичной структурой мРНК, добавленной в систему. Если бесклеточная система составлена с глоби-новой мРНК (ее можно выделить из ретикулоцитов), синтезируется глобин (а- и (3-цепи глобина); если с альбуминовой мРНК, выделяемой из гепатоцитов, синтезируется альбумин, и т. д.
14. Значение репликации:
а) процесс является важным молекулярным механизмом, лежащим в основе всех разновидностей деления клеток проэукариот, б) обеспечивает все типы размножения как одноклеточных, так и многоклеточных организмов,
в) поддерживает постоянство клеточного
состава органов, тканей и организма в результате физиологической регенерации
г) обеспечивает длительное существование отдельных индивидуумов;
д) обеспечивает длительное существование видов организмов;
е) процесс способствует точному удвоениюинформации;
ж) в процессе репликации возможны ошибки (мутации) , что может приводить к нарушениям синтеза белков с развитием патологических изменений.
Уникальное свойство молекулы ДНК удваиваться перед делением клетки называется репликацией.
Особые свойства нативной ДНК как носителя наследственной информации:
1) реплицирование – образование новых цепей комплиментарно;
2) самокоррекция – ДНК-полимераза отщепляет ошибочно реплицированные участки (10-6);
3) репарация - восстановление;
Осуществление этих процессов происходит в клетке с участием специальных ферментов.
Как устроена система репарации Эксперименты, позволившие выявить механизмы восстановления и само существование этой способности, проводились с помощью одноклеточных организмов. Но процессы репарации присущи живым клеткам животных и человека. Некоторые люди страдают пигментной ксеродермой. Это заболевание вызвано отсутствием способности клеток ресинтезировать поврежденную ДНК. Ксеродерма передается по наследству. Из чего же состоит репарационная система? Четыре фермента, на которых держится процесс репарации – это ДНК-хеликаза, -экзонуклеаза, -полимераза и -лигаза. Первый из этих соединений способен распознавать повреждения в цепи молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты. Он не только распознает, но и обрезает цепь в нужном месте, чтобы удалить измененный отрезок молекулы. Само устранение осуществляется с помощью ДНК-экзонуклеазы. Далее происходит синтез нового участка молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты из аминокислот с целью полностью заменить поврежденный отрезок. Ну и финальный аккорд этой сложнейшей биологической процедуры совершается с помощью фермента ДНК-лигазы. Он отвечает за прикрепление синтезированного участка к поврежденной молекуле. После того как все четыре фермента сделали свою работу, молекула ДНК полностью обновлена и все повреждения остаются в прошлом. Вот так слаженно работают механизмы внутри живой клетки.
Классификация На данный момент ученые выделяют следующие разновидности систем репарации. Они активируются в зависимости от разных факторов. К ним относятся: Реактивация. Рекомбинационное восстановление. Репарация гетеродуплексов. Эксцизионная репарация. Воссоединение негомологичных концов молекул ДНК. Все одноклеточные организмы обладают как минимум тремя ферментными системами. Каждая из них обладает способностью осуществлять процесс восстановления. К этим системам относят: прямую, эксцизионную и пострепликативную. Этими тремя видами восстановления ДНК обладают прокариоты. Что касается эукариот, то в их распоряжении находятся дополнительные механизмы, которые называются Miss-mathe и Sos-репарация. Биология подробно изучила все эти виды самовосстановления генетического материала клеток.
15. Генети́ческий код - это свойственный всем живым организмам способ кодирования аминокислотной последовательности белков при помощи последовательности нуклеотидов. Аминокислотная последовательность в молекуле белка зашифрована в виде нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК и называется генетическим кодом. Участок молекулы ДНК, ответственный за синтез одного белка, называется геном.
В ДНК используется четыре нуклеотида - аденин (А), гуанин (G), цитозин (С), тимин (T), которые в русскоязычной литературе обозначаются буквами А, Г, Ц и Т. Эти буквы составляют алфавит генетического кода. В РНК используются те же нуклеотиды, за исключением тимина, который заменён похожим нуклеотидом - урацилом, который обозначается буквой U (У в русскоязычной литературе). В молекулах ДНК и РНК нуклеотиды выстраиваются в цепочки и, таким образом, получаются последовательности генетических букв.
Для построения белков в природе используется 20 различных аминокислот. Каждый белок представляет собой цепочку или несколько цепочек аминокислот в строго определённой последовательности. Эта последовательность определяет строение белка, а следовательно все его биологические свойства. Набор аминокислот также универсален для почти всех живых организмов.
Реализация генетической информации в живых клетках (то есть синтез белка, кодируемого геном) осуществляется при помощи двух матричных процессов: транскрипции (то есть синтеза иРНК на матрице ДНК) и трансляции генетического кода в аминокислотную последовательность (синтез полипептидной цепи на матрице иРНК). Для кодирования 20 аминокислот, а также сигнала «стоп», означающего конец белковой последовательности, достаточно трёх последовательных нуклеотидов. Набор из трёх нуклеотидов называется триплетом. Принятые сокращения, соответствующие аминокислотам и кодонам, изображены на рисунке.
Свойства генетического кода
Триплетность - значащей единицей кода является сочетание трёх нуклеотидов (триплет, или кодон).
Непрерывность - между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно.
Неперекрываемость - один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов. (Не соблюдается для некоторых перекрывающихся генов вирусов, митохондрий и бактерий, которые кодируют несколько белков, считывающихся со сдвигом рамки).
Однозначность - определённый кодон соответствует только одной аминокислоте. (Свойство не является универсальным. Кодон UGA у Euplotes crassus кодирует две аминокислоты - цистеин и селеноцистеин)
Вырожденность (избыточность) - одной и той же аминокислоте может соответствовать несколько кодонов.
Универсальность - генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности - от вирусов до человека (на этом основаны методы генной инженерии) (Из этого свойства также есть ряд исключений, см. таблицу в разделе "Вариации стандартного генетического кода" в данной статье).
16.Условия биосинтеза
Для биосинтеза белка необходима генетическая информация молекулы ДНК; информационная РНК - переносчик этой информации из ядра к месту синтеза; рибосомы - органоиды, где происходит собственно синтез белка; набор аминокислот в цитоплазме; транспортные РНК, кодирующие аминокислоты и переносящие их к месту синтеза на рибосомы; АТФ - вещество, обеспечивающее энергией процесс кодирования и биосинтеза.
Этапы
Транскрипция - процесс биосинтеза всех видов РНК на матрице ДНК, который протекает в ядре.
Определенный участок молекулы ДНК деспирализуется, водородные связи между двумя цепочками разрушаются под действием ферментов. На одной цепи ДНК, как на матрице, по принципу комплементарное из нуклеотидов синтезируется РНК-копия. В зависимости от участка ДНК таким образом синтезируются рибосомные, транспортные, информационные РНК.
После синтеза иРНК она выходит из ядра и направляется в цитоплазму к месту синтеза белка на рибосомы.
Трансляция - процесс синтеза полипептидных цепей, осуществляемый на рибосомах, где иРНК является посредником в передаче информации о первичной структуре белка.
Биосинтез белка состоит из ряда реакций.
1. Активирование и кодирование аминокислот. тРНК имеет вид клеверного листа, в центральной петле которого располагается триплет-ный антикодон, соответствующий коду определенной аминокислоты и кодону на иРНК. Каждая аминокислота соединяется с соответствующей тРНК за счет энергии АТФ. Образуется комплекс тРНК-аминокислота, который поступает на рибосомы.
2. Образование комплекса иРНК-рибосома. иРНК в цитоплазме соединяется рибосомами на гранулярной ЭПС.
3. Сборка полипептидной цепи. тРНК с аминокислотами по принципу комплементарности антикодона с кодоном соединяются с иРНК и входят в рибосому. В пептидном центре рибосомы между двумя аминокислотами образуется пептидная связь, а освободившаяся тРНК покидает рибосому. При этом иРНК каждый раз продвигается на один триплет, внося новую тРНК - аминокислоту и вынося из рибосомы освободившуюся тРНК. Весь процесс обеспечивается энергией АТФ. Одна иРНК может соединяться с несколькими рибосомами, образуя полисому, где идет одновременно синтез многих молекул одного белка. Синтез заканчивается, когда на иРНК начинаются бессмысленные кодоны (стоп-коды). Рибосомы отделяются от иРНК, с них снимаются полипептидные цепи. Так как весь процесс синтеза протекает на гранулярной эндо-плазматической сети, то образовавшиеся полипептидные цепи поступают в канальца ЭПС, где приобретают окончательную структуру и превращаются в молекулы белка.
Все реакции синтеза катализируются специальными ферментами с затратой энергии АТФ. Скорость синтеза очень велика и зависит от длины полипептида. Например, в рибосоме кишечной палочки белок из 300 аминокислот синтезируется приблизительно за 15-20 с.
Аминоацил-тРНК-синтетаза (АРСаза) - фермент синтетаза, катализирующий образование аминоацил-тРНК в реакции этерификации определенной аминокислоты с соответствующей ей молекулой тРНК. Для каждой аминокислоты существует своя аминоацил-тРНК-синтетаза. АРСазы обеспечивают соответствие нуклеотидным триплетам генетического кода (антикодону тРНК) встраиваемых в белок аминокислот, и, таким образом, обеспечивают правильность происходящего в дальнейшем считывания генетической информации с мРНК при синтезе белков на рибосомах. Большинство АРС-аз состоят из 1, 2 или 4 одинаковых полипептидных цепей. Молекулярная масса полипептидных цепей 30-140 тыс. Многие АРС-азы содержат два активных центра. Имеется 3 участка. 1-ый участок не обладает специфичностью, он одинаков для всех ферментов, это место присоединения АТФ. П-ой участок обладает строгой специфичностью, сюда присоединяется определенная АК, по которой и называется АРСаза, например, если она присоединяет метионин, то называется метионил-т-РНК-синтетаза. Ш-й участок также является строго специфичным участком, может соединиться только с опеределенной т-РНК. Таким образом, фермент необходим для узнавания аминокислоты и т-РНК.
Специфичность реакций, катализируемых АРС-азами, очень высока, что определяет точность белкового синтеза в живой клетке. Если А. осуществит ошибочное аминоацилирование тРНК близкой по структуре аминокислотой, произойдет коррекция путем катализируемого той же АРС-азы гидролиза ошибочных АК-тРНК до АК и тРНК. В цитоплазме содержится полный набор АРС-аз, в хлоропластах и митохондриях есть свои АРС-азы.
Транспортная РНК. Строение, функции. Строение рибосом.
Все тРНК имеют общие черты как в их первичной структуре, так и в способе складывания полинуклеотидной цепи во вторичную структуру за счет взаимодействий между основаниями нуклеотидных остатков.
Первичная структура тРНК
тРНК - относительно небольшие молекулы, длина их цепей варьирует от 74 до 95 нуклеотидных остатков. Все тРНК имеют одинаковый 3"-конец, построенный из двух остатков цитозина и одного - аденозина (CCA-конец). Именно 3"-концевой аденозин связывается с аминокислотным остатком при образовании аминоацил-тРНК. CCA-конец присоединяется ко многим тРНК с помощью специального фермента. Нуклеотидный триплет, комплементарный кодону для аминокислоты (антикодон), находится приблизительно в середине цепи тРНК. В отдельных положениях последовательности практически у всех видов тРНК встречаются одни и те же (консервативные) нуклеотидные остатки. В некоторых положениях могут находиться или только пуриновые, или только пиримидиновые основания (их называют полуконсервативными остатками).
Для всех молекул тРНК характерно присутствие большого числа (до 25% всех остатков) разнообразных модифицированных нуклеозидов, часто называемых минорными. Они образуются в различных местах молекул, во многих случаях четко определенных, в результате модификации обычных нуклеозидных остатков с помощью специальных ферментов.
Вторичная структура тРНК
складывания цепи во вторичную структуру происходит за счет взаимокомплементарности участков цепи. Три фрагмента цепи оказываются комплементарными при складывании их на себя, образуя шпилькообразные структуры. Кроме того, 5"-конец комплементарен участку, близкому к 3"-концу цепи, при их антипараллельном расположении; они формируют так называемый акцепторный стебель. В результате образуется структура, характеризующаяся наличием четырех стеблей и трех петель, которая получила название "клеверного листа". Стебель с петлей формируют ветвь. Внизу расположена антикодоновая ветвь, содержащая антикодоновый триплет в составе своей петли. Слева и справа от нее расположены D- и T-ветви, соответственно названные так из-за присутствия в их петлях необычных консервативных нуклеозидов дигидроуридина (D) и тимидина (T). Нуклеотидные последовательности всех изученных тРНК могут быть сложены в аналогичные структуры. В дополнение к трем петлям клеверного листа в структуре тРНК выделяют также дополнительную, или вариабельную, петлю (V-петлю). Ее размеры резко различаются у разных тРНК, варьируя, от 4 до 21 нуклеотида, а по последним данным, и до 24 нуклеотидов.
Пространственная (третичная) структура тРНК
За счет взаимодействия элементов вторичной структуры формируется третичная структура, которая получила название L-формы из-за сходства с латинской буквой L (рис. 2 и 3). За счет стэкинга оснований акцепторный стебель и T-стебель клеверного листа образуют одну непрерывную двойную спираль, а два других стебля - антикодоновый и D - другую непрерывную двойную спираль. При этом D- и T-петли оказываются сближенными и скрепляются между собой путем образования дополнительных, часто необычных пар оснований. В образовании этих пар, как правило, принимают участие консервативные или полуконсервативные остатки. Аналогичные третичные взаимодействия скрепляют и некоторые другие участки L-структуры
Основное назначение транспортной РНК (тРНК) - доставлять активированные остатки аминокислот в рибосому и обеспечивать их включение в синтезирующуюся белковую цепь в соответствии с программой, записанной генетическим кодом в матричной, или информационной, РНК (мРНК).
Строение рибосом.
Рибосомы представляют собой рибонуклео-протеиновые образования - своеобразные "фабрики", на которых идёт сборка аминокислот в белки. Эукариотические рибосомы имеют константу седиментации 80S и состоят из 40S (малой) и 60S (большой) субъединиц. Каждая субъединица включает рРНК и белки.
Белки входят в состав субъединиц рибосомы в количестве одной копии и выполняют структурную функцию, обеспечивая взаимодействие между мРНК и тРНК, связанными с аминокислотой или пептидом.
В присутствии мРНК 40S и 60S субъединицы объединяются с образованием полной рибосомы, масса которой примерно в 650 раз больше массы молекулы гемоглобина.
По-видимому, рРНК определяет основные структурные и функциональные свойства рибосом, в частности обеспечивает целостность рибосомных субъединиц, обусловливает их форму и ряд структурных особенностей.
Объединение большой и малой субъединицы происходит в присутствии матричной (информационной) РНК (мРНК). Одна молекула мРНК обычно объединяет несколько рибосом наподобие нитки бус. Такую структуру называют полисомой. Полисомы свободно располагаются в основном веществе цитоплазмы или прикреплены к мембранам шероховатой цитоплазматической сети. В обоих случаях они служат местом активного синтеза белка.
Так же как и эндоплазматическая сеть, рибосомы были открыты только с помощью электронного микроскопа. Рибосомы - самые маленькие из клеточных органелл.
В рибосоме есть 2 центра для присоединения молекул тРНК: аминоацильный (А) и пептидильный (Р) центры, в образовании которых участвуют обе субъединицы. Вместе центры А и Р включают участок мРНК, равный 2 кодонам. В ходе трансляции центр А связывает аа-тРНК, строение которой определяет кодон, находящийся в области этого центра. В структуре этого кодона зашифрована природа аминокислоты, которая будет включена в растущую полипептидную цепь. Центр Р занимает пептидил-тРНК, т.е. тРНК, связанная с пептидной цепочкой, которая уже синтезирована.
У эукариотов различают рибосомы 2 типов: "свободные", обнаруживаемые в цитоплазме клеток, и связанные с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР). Рибосомы, ассоциированные с ЭР, ответственны за синтез белков "на экспорт", которые выходят в плазму крови и участвуют в обновлении белков ЭР, мембраны аппарата Гольджи, митохондрий или лизосом
Синтез полипептидной молекулы. Инициация и элонгация.
Синтез белка представляет собой циклический многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуется в генетически детерминированную последовательность с образованием полипептидов.
Второй этап матричного синтеза белка, собственно трансляцию, протекающей в рибосоме, условно делят на три стадии: инициации, элонгации и терминации.
Инициация.
Последовательность ДНК, транскрибирующаяся в одну иРНК, начинающаяся просмотром на 5` конце и заканчивающаяся терминатором на 3`-конце, является единицей транскрипции и соответствует понятию «ген». Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе трансляции – инициация. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор – фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция происходит в направлении 5`-3`или слева направо. Последовательности, лежащие вправо от стартового нуклеитида, с которого начинается синтез тРНК, обозначаются номерами со знаком + (+1,+2..) а находящиеся левее со знаком – (-1,-2). Таким образом, область ДНК, к кторой присоединяется ДНК-полимераза, занимает участок с координатами примерно от -20 до +20. Во всех промоторах присутствуют одни и те же нуклеотидные последовательности., называемые консервативными. Такие последовательности служат сигналами, распознаваемыми РНК-полимеразами. Стартовая точка обычно представлена пурином. Сразу же влево от нее располагается 6-9 п.н., известные как последовательность (или ящик) Прибнова: ТАТААТ. Она может несколько варьировать, но первые два основания встреяаются в большинстве промоторов. Предполагается, что, поскольку ее образуют участок, богатый АТ-парами, связаны двумя водородными связями, ДНК в этом месте легче разделяется на отдельные нити. Это создает условия для функционирования РНК-полимеразы. Наряду с этим ящик Прибнова необходим для ориентирования таким образом, чтобы синтез иРНК шел слева направо т.е с 5`-3`. Центр ящика Прибнова находитя на нуклеотиде -10. Близкая по составу последовательность расположена в другом участке с центром в положении – 35.Этот участок состоящий из 9 п.н.обозначают как последовательность 35 или район распознавания. Он является сайтом, к которому присоединяется фактор, тем самым определяя эффективность, с которой РНК-полимераза не может начать транскрипцию без специальных белков. Одним из них служит фактор CAP или СRP.
У эукариот более подробно изучены промоторы, взаимодействующие с РНК-полимеразой II. Они содержат три гомологичных участка в районах с координатами в точках -25,-27 а также в стартовой точке. Стартовыми основаниями служат аденин, фланкированных с обеих сторон пиримидинами. На расстоянии 19-25 п.н. влево от участка расположены 7 п.н. ТАТАА, известны как последовательность ТАТА, или ящик «Хогнесса», часто он окружен участками, богатые ГЦ-парами. Еще левее в положении от -70 до -80 находится последовательность ГТЦ или ЦААТЦТ, называемая ящик ЦААТ. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ – первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей.
Элонгация. Стадия элонгации иРНК имеет сходства с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеотидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, то есть рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеотидмонофосфатов к 3`-концуцепи с освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно происходит на ограниченном участке ДНК (гене), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через неколько сцепленных генов, формирующих единый оперон, и одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.
Регуляция активности генов на примере лактозного оперона.
Лактозный оперон - полицистронный оперон бактерий, кодирующий гены метаболизма лактозы.
Регуляция экспрессии генов метаболизма лактозы у кишечной палочки была впервые описана в 1961 году учеными Ф. Жакобом и Ж. Моно. Бактериальная клетка синтезирует ферменты, принимающие участие в метаболизме лактозы, лишь в том случае, когда лактоза присутствует в окружающей среде и клетка испытывает недостаток глюкозы.
Лактозный оперон состоит из трех структурных генов, промотора, оператора и терминатора. Принимается, что в состав оперона входит также ген-регулятор, который кодирует белок-репрессор.
Структурные гены лактозного оперона - lacZ, lacY и lacA:
lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, которая расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу,
lacY кодирует β-галактозид пермеазу, мембранный транспортный белок, который переносит лактозу внутрь клетки.
lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу, фермент, переносящий ацетильную группу от ацетил-КoA на бета-галактозиды.
В начале каждого оперона находится специальный ген - ген оператор. На структурных генах одного оперона обычно образуется одна м-РНК, и эти гены бывают одновременно активны или неактивны. Как правило, структурные гены в опероне находятся в состоянии репрессии.
Промотор - участок ДНК, опознаваемый ферментом РНК- полимеразой, обеспечивающим синтез м-РНК в опероне предшествует участок ДНК, к которому присоединяется Сар-белок - белок активатор. Эти два участка ДНК состоят из 85 нуклеотидных пар. После промотора в опероне размещается ген - оператор, состоящий из 21 нуклеотидной пары С ним обычно и бывает связан белок - репрессор, вырабатываемый геном-регулятором За геном-оператором располагается спейсер (space -промежуток). Спейсеры - неинформативные участки молекулы ДНК различной длины (иногда до 20000 пар оснований), которые, по видимому, принимают участие в регулировании процесса транскрипции соседнего гена.
Заканчивается оперон терминатором - небольшим участком ДНК, который служит стоп-сигналом синтеза м-РНК на данном опероне.
Акцепторные гены служат местом прикрепления различных белков, регулирующих работу структурных генов. Если лактоза, проникая в клетку (ее в данном случае называют индуктором), блокирует белки, кодируемые геном-регулятором, то они теряют способность присоединяться к гену-оператору. Ген-оператор переходит в активное состояние и включает в работу структурные гены.
РНК-полимераза с помощью Cap-белка (белка-активатора) присоединяется к промотору и, продвигаясь по оперону, синтезирует про-м-РНК. При транскрипции м-РНК считывает генетическую информацию со всех структурных генов в одном опероне. При трансляции на рибосоме происходит синтез нескольких разных полипептидных цепей, в соответствии с содержащимися в м-РНК кодонами - последовательностями нуклеотидов, обеспечивающих инициацию и терминацию трансляции каждой цепи. Тип регуляции работы генов, рассмотренной на примере лактозного оперона, называется негативной индукцией синтеза белка.
Регуляция активности генов на примере триптофанового оперона.
Другим типом регуляции работы генов служит негативная репрессия, изученная у E.coU на примере оперона, контролирующего синтез аминокислоты триптофона. Этот оперон состоит из 6700 пар нуклеотидов и содержит 5 структурных генов, ген оператор и два промотора. Ген регулятор обеспечивает постоянный синтез регуляторного белка, который не влияет на работу trp - оперона. При избытке в клетке триптофана последний соединяется с регуляторным белком и изменяет его таким образом, что он связывается с о перо ном и репрессирует синтез соответствующей м-РНК.
Негативный и позитивный контроль генетической активности.
Известна также и так называемая позитивная индукция, когда белковый продукт гена-регулятора активирует работу оперона, т.е. является не репрессором, а активатором Деление это условно, и строение акцепторной части оперона, действие гена - регулятора у прокариот весьма разнообразны.
Число структурных генов в опероне у прокариот колеблется от одного до двенадцати; оперон может иметь либо один, либо два промотора и терминатора. Все структурные гены, локализованные в одном опероне, как правило, контролируют систему ферментов, обеспечивающих одну цепь биохимических реакций. Несомненно, что в клетке существуют системы, согласующие регуляцию работы нескольких оперонов.
К первой части акцептора гена - оператора присоединяются белки, активирующие синтез м-РНК, а к концу его - белки - репрессоры, подавляющие синтез м-РНК. Один ген регулируется одним из нескольких белков, каждый из которых прикрепляется к соответствующей точке акцептора. Разные же гены могут иметь общие регуляторы и одинаковые операторные участки. Гены - регуляторы действуют не одновременно. Сначала один включает сразу одну группу генов, затем через некоторое время другой - другую группу, т.е. регуляция активности генов происходит «каскадами», причем белок синтезированный в одной стадии, может быть регулятором синтеза белков следующей стадии.
Строение хромосом. Кариотип. Идиограмма. Модели строения хромосом.
Хромосомы эукариот имеют сложное строение. Основу хромосомы составляет линейная (не замкнутая в кольцо) макромолекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) значительной длины (например, в молекулах ДНК хромосом человека насчитывается от 50 до 245 миллионов пар азотистых оснований). В растянутом виде длина хромосомы человека может достигать 5 см. Помимо неё, в состав хромосомы входят пять специализированных белков - H1, H2A, H2B, H3 и H4 (так называемые гистоны) и ряд негистоновых белков. Последовательность аминокислот гистонов высококонсервативна и практически не различается в самых разных группах организмов. В интерфазе хроматин не конденсирован, но и в это время его нити представляют собой комплекс из ДНК и белков. Хроматин представляет собой дезоксирибонуклеопротеид, выявляемый под световым микроскопом в виде тонких нитей и гранул. Макромолекула ДНК обвивает октомеры (структуры, состоящую из восьми белковых глобул) гистоновых белков H2A, H2B, H3 и H4, образуя структуры, названные нуклеосомами.
В целом вся конструкция несколько напоминает бусы. Последовательность из таких нуклеосом, соединённых белком H1, называется нуклеофиламентом, или нуклеосомной нитью, диаметром около 10 нм.
Конденсированная хромосома имеет вид буквы X (часто с неравными плечами), поскольку две хроматиды, возникшие в результате репликации, по-прежнему соединены между собой в районе центромеры. Каждая клетка тела человека содержит в точности 46 хромосом. Хромосомы всегда парны. В клетке всегда имеется по 2 хромосомы каждого вида, пары отличаются друг от друга по длине, форме и наличию утолщений или перетяжек.
Центромера - особым образом организованный участок хромосомы, общий для обеих сестринских хроматид. Центромера делит тело хромосомы на два плеча. В зависимости от расположения первичной перетяжки различают следующие типы хромосом: равноплечие (метацентрические), когда центромера расположена посередине, а плечи примерно равной длины; неравноплечие (субметацентрические), когда центромера смещена от середины хромосомы, а плечи неравной длины; палочковидные (акроцентрические), когда центромера смещена к одному концу хромосомы и одно плечо очень короткое. В некоторых хромосомах могут быть вторичные перетяжки, отделяющие от тела хромосомы участок, называемый спутником.
Изучение химической организации хромосом эукариотических клеток показало, что они состоят в основном из ДНК и белков. Как было доказано многочисленными исследованиями, ДНК является материальным носителем свойств наследственности и изменчивости и заключает в себе биологическую информацию - программу развития клетки, организма, записанную с помощью особого кода. Белки составляют значительную часть вещества хромосом (около 65% массы этих структур). Хромосома как комплекс генов представляет собой эволюционно сложившуюся структуру, свойственную всем особям данного вида. Взаимное расположение генов в составе хромосомы играет немаловажную роль в характере их функционирования..
Графическое изображение кариотипа, показывающие его структурные особенности, называется идиограммой.
Специфический для определенного вида по числу и структуре набор хромосом получил название кариотипа.
Гистоны. Структура нуклеосом.
Гистоны - основной класс нуклеопротеинов, ядерных белков, необходимых для сборки и упаковки нитей ДНК в хромосомы. Существует пять различных типов гистонов, названных H1/Н5, H2A, H2B, H3, H4. Последовательность аминокислот в этих белках практически не различается в организмах различного уровня организации. Гистоны - небольшие, сильно основные белки, связывающиеся непосредственно с ДНК. Гистоны принимают участие в структурной организации хроматина, нейтрализуя за счет положительных зарядов аминокислотных остатков отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК, что делает возможной плотную упаковку ДНК в ядре.
По две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 составляют октамер, обвитый сегментом ДНК длиной 146 п.о., образующим 1,8 витка спирали поверх белковой структуры. Эта частица диаметром 7 нм называется нуклеосомой. Участок ДНК (линкерная ДНК), непосредственно не контактирующий с гистоновым октамером, взаимодействует с гистоном Н1.
Группа негистоновых белков высоко гетерогенна и включает структурные ядерные белки, множество ферментов и факторов транскрипции, связанных с определенными участками ДНК и осуществляющих регуляцию генной экспрессии и других процессов.
Гистоны в октамере имеют подвижный N-концевой фрагмент («хвост») из 20 аминокислот, который выступает из нуклеосом и важен для поддержания структуры хроматина и контроля за генной экспрессией. Так, например, формирование (конденсация) хромосом связано с фосфорилированием гистонов, а усиление транскрипции - с ацетилированием в них остатков лизина. Детали механизма регуляции до конца не выяснены.
Нуклеосома - субъединица хроматина, состоящая из ДНК и набора из четырех пар гистоновых белков Н2А, Н2В, Н3 и Н4 одной молекулы гистона H1. Гистон Н1 связывается с линкерной ДНК между двумя нуклеосомами.
Нуклеосома является элементарной единицей упаковки хроматина. Она состоит из двойной спирали ДНК, обмотанной вокруг специфического комплекса из восьми нуклеосомных гистонов (гистонового октамера). Нуклеосома представляет собой дисковидную частицу с диаметром около 11 нм, содержащую по две копии каждого из нуклеосомных гистонов (Н2A, Н2В, НЗ, Н4). Гистоновый октамер образует белковую сердцевину, вокруг которой дважды обмотана двуспиральная ДНК (146 нуклеотидных пар ДНК на гистоновый октамер).
Нуклеосомы, входящие в состав фибрилл, расположены более или менее равномерно вдоль молекулы ДНК на расстоянии 10-20 нм друг от друга.
Уровни упаковки хромосом эукариот. Конденсация хроматина.
Таким образом, уровни упаковки ДНК следующие:
1) Нуклеосомный (2,5 оборота двуспиральной ДНК вокруг восьми молекул гистоновых белков).
2) Супернуклеосомный - хроматиновая спираль (хромонема).
3) Хроматидный - спирализованная хромонема.
4) Хромосома - четвертая степень сперализации ДНК.
В интерфазном ядре хромосомы деконденсированы и представлены хроматином. Деспирализованный участок, содержащий гены, называется эухроматин (разрыхленный, волокнистый хроматин). Это необходимое условие для транскрипции. Во время покоя между делениями определенные участки хромосом и целые хромосомы остаются компактными.
Эти спирализованные, сильно окрашивающиеся участки, называются гетерохроматином. Они неактивны в отношении транскрипции. Различают факультативный и конститутивный гетерохроматин.
Факультативный гетерохроматин информативен, т.к. содержит гены и может переходить в эухроматин. Из двух гомологичных хромосом одна может гетерохроматической. Конститутивный гетерохроматин всегда гетерохроматичен, неиформативен (не содержит генов) и поэтому всегда неактивен в отношении транскрипции.
Хромосомная ДНК состоит из более 108 пар оснований, из которых образуется информативные блоки - гены, расположенные линейно. На их долю приходится до 25% ДНК. Ген - функциональная единица ДНК, содержащая информацию для синтеза полипептидов, или всех РНК. Между генами находятся спейсеры - неинформативные отрезки ДНК разной длины. Избыточные гены представлены большим числом - 104 идентичных копий. Примером являются гены для т-РНК, р-РНК, гистонов. В ДНК встречаются последовательности одних и тех же нуклеотидов. Они могут быть умеренно повторяющимися и высоко повторяющимися последовательностями. Умеренно повторяющиеся последовательности достигают 300 пар нуклеотидов с повторениями 102 - 104 и представляют чаще всего спейсеры, избыточные гены.
Высокоповторяющиеся последовательности (105 - 106) образуют конститутивный гетерохроматин. Около 75% всего хроматина не участвует в транскрипции, он приходится на высокоповторяющиеся последовательности и нетранскрибируемые спейсеры.
Приготовление хромосомных препаратов. Использование колхицина. Гипотония, фиксация и окрашивание.
В зависимости от степени пролиферативной активности клеток разных тканей in vivo и in vitro различают прямые и непрямые методы получения препаратов хромосом.
1) Прямые методы используются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, хорион и плацента, клетки лимфатических узлов, ткани эмбриона на ранней стадии развития). Препараты хромосом готовятся непосредственно из свежеполученного материала после специальной обработки.
2) Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после ее предварительного культивирования в течение различного периода времени.
Существует множество модификаций прямого и непрямого методов приготовления хромосомных препаратов, однако основные этапы получения метафазных пластинок остаются неизменными:
1. Использование колхицина (колцемида) - ингибитора образования митотического веретена, который останавливает деление клеток на стадии метафазы.
2. Гипотонический шок с использованием растворов солей калия или натрия, которые вследствие разницы осмотического давления внутри и снаружи клеток вызывают их набухание и разрыв межхромосомных связей. Такая процедура приводит к отделению хромосом друг от друга, способствуя более сильному их разбросу в метафазных пластинках.
3. Фиксация клеток с использованием ледяной уксусной кислоты и этанола (метанола) в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа), что способствует сохранению структуры хромосом.
4. Раскапывание суспензии клеток на предметные стекла.
5. Окрашивание хромосомных препаратов.
Разработан ряд методов окрашивания (бэндинга), позволяющих выявить комплекс поперечных меток (полос, бэндов) на хромосоме. Каждая хромосома характеризуется специфическим комплексом полос. Гомологичные хромосомы окрашиваются идентично, за исключением полиморфных районов, где локализуются разные аллельные варианты генов. Аллельный полиморфизм характерен для многих генов и встречается в большинстве популяций. Выявление полиморфизмов на цитогенетическом уровне не имеет диагностического значения.
А. Q-окрашивание. Первый метод дифференциального окрашивания хромосом был разработан шведским цитологом Касперссоном, использовавшим с этой целью флюоресцентный краситель акрихин-иприт. Под люминесцентным микроскопом на хромосомах видны участки с неодинаковой интенсивностью флюоресценции - Q-сегменты. Метод лучше всего подходит для исследования Y-хромосом и потому используется для быстрого определения генетического пола, выявления транслокаций (обменов участками) между X- и Y-хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, а также для просмотра большого числа клеток, когда необходимо выяснить, имеется ли у больного с мозаицизмом по половым хромосомам клон клеток, несущих Y-хромосому.
Б. G-окрашивание. После интенсивной предварительной обработки, часто с применением трипсина, хромосомы окрашивают красителем Гимзы. Под световым микроскопом на хромосомах видны светлые и темные полосы - G-сегменты. Хотя расположение Q-сегментов соответствует расположению G-сегментов, G-окрашивание оказалось более чувствительным и заняло место Q-окрашивания в качестве стандартного метода цитогенетического анализа. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).
В. R-окрашивание дает картину, противоположную G-окрашиванию. Обычно используют краситель Гимзы или флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый. Этим методом выявляют различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.
Г. C-окрашивание используют для анализа центромерных районов хромосом (эти районы содержат конститутивный гетерохроматин) и вариабельной, ярко флюоресцирующей дистальной части Y-хромосомы.
Д. T-окрашивание применяют для анализа теломерных районов хромосом. Эту методику, а также окрашивание районов ядрышковых организаторов азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) используют для уточнения результатов, полученных путем стандартного окрашивания хромосом.