Анализ прямая проба кумбса. Проба кумбса при диагностике гемолитической болезни новорожденных
Антитела , находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии вплазме крови . В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап - добавляетсяантиглобулиновая сыворотка . Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходитагглютинация эритроцитов.
Непрямая реакция
Непрямая реакция Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса - добавление антиглобулиновой сыворотки.
Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом . Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.
|
Реакция кольцепреципитации . Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата . Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен). | |
|
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони . Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются. |
|
|
Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др. |
|
|
Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммуннук сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации. |
|
|
Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. f1оecus - хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин - антитоксин или анатоксин - антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. |
HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса. Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.
Задачи при HLA типировании могут стоять самые разные - биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров для пересадки органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей донора и реципиента. С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать случаи бесплодия.
HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя методами - серологическим и молекулярно-генетическим. Классический серологический метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте, а молекулярный метод использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).
Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях. Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты. Поэтому суспензию Т лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов I класса, и суспензию В лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель части клеток. Второй способ признан более специфичным - при этом более 95% клеток остаются жизнеспособными.
Но основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие - нет.
Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора, содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки. Оценивают серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция) реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток. Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции цитотоксичности.
Недостатками серологического HLA типирования являются наличие перекрестных реакций, слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов.
Более современные, молекулярные методы HLA типирования используют уже стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.
Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом которой является получение чистой геномной ДНК (из цельной крови, лейкоцитарной суспензии, тканей).
Затем образец ДНК копируется - амплифицируется в пробирке с использованием праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA -локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном случае амплификация не осуществляется.
После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы. Результат HLA типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном уровнях. Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA типирование точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (больше новых аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой именно антиген присутствует на клетке.
Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).
Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую-щих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.
Иммунофлюоресцентный метод
(РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-д-ки инфекц. заболеваний (идентификация возбудителя в иссл. материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямой И. м. состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной к-ры с-кой, содержащей специфические Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и рассматривают в люминесцентный микроскоп. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. Принепрямом. И. м. на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующей специфической с-кой, на втором -люминесцирующей с-кой против-глобулинов того животного, с-ка к-рого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод). Кроме люминесцентного микроскопа для учета РИФ при фенотипировании клеток применяютлазерный сортировщик клеток .
Проточная цитометрия - метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.
Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.
Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:
рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.
Антиглобулиновый тест, или реакция Кумбса проводится для того, чтобы выявить определенные антитела, которые атакуют красные кровяные клетки (эритроциты).
Антитела это белки, производимые иммунной системой. Как правило, антитела связываются с посторонними веществами, такими как бактерии и вирусы, и уничтожают их.
В нашей клинике есть профильные специалисты по данному вопросу.
(4 специалиста)
2. Зачем нужен тест на антитела?
Тест на антитела может проводиться в следующих случаях:
Перед переливанием крови
Вы наверняка знаете, что у человека может быть одна из четырех групп крови. И антиглобулиновый тест можно проводить для определения возможности переливания крови. Если вам делают переливание, кровь донора должна соответствовать вашему типу (иметь одинаковые антигены). Если при переливании антигены отличаются, иммунная система разрушит перелитые клетки. Это может привести к серьезным заболеваниям и даже смерти. Именно поэтому поиск нужного типа крови является столь важным фактором.
Для выявления риска резус-сенсибилизации
Резус это антиген. Его полное название - резус-фактор. Тест Кумбса используется для обнаружения антител к резус-фактору в крови у беременных женщин. Если женщина с отрицательным резус-фактором крови беременна ребенком с положительным резус-фактором (он может передаваться от отца), есть риск наступления резус-сенсибилизации. Резус- сенсибилизация происходит, когда кровь ребенка смешивается с кровью матери во время беременности или родов. Если группа крови матери несовместима с группой крови ребенка, то ее иммунная система может атаковать плод, воспринимая его чужеродным объектом. При этом может развиться тяжелое заболевание, именуемое эритробластозой плода. В редких случаях, если заболевание не лечить, плод или новорожденный могут погибнуть.
Женщине с отрицательным резус-фактором крови могут провести инъекцию анти-Rh- гаммаглобулина (например, RhoGAM), используемого для предотвращения развития Rh- гемолитической болезни.
Для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии
Аутоиммунная гемолитическая анемия является редким заболеванием, связанным с образованием антител к собственным антигенам эритроцитов.
3. Типы антиглобулиновой пробы
Существуют два типа антиглобулиновой пробы, или реакции Кумбса: прямой и непрямой.
Прямая реакция Кумбса, или прямой антиглобулиновый тест обнаруживает антитела, связанные с эритроцитами. Он используется для определения анемии. При этой болезни эритроциты разрушаются быстрее, чем производятся.
Непрямая реакция Кумбса, или непрямой антиглобулиновый тест проводится для поиска антител, не связанных с эритроцитами. Для пробы используется сыворотка крови, в которой и находятся антитела. Эта процедура достаточно редкая: в основном ее проводят для определения возможности переливания крови или как этап обследования беременных женщин.
4. Результаты реакции Кумбса
Норма:
Отрицательный результат теста - антитела не обнаружены.
- Прямой тест Кумбса . Отрицательный результат прямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь не имеет антител, связанных с эритроцитами.
- Непрямой тест Кумбса . Отрицательный результат непрямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь совместима с кровью донора. Для беременной женщины такой результат означает, что ее организм не выработал антитела против резус- положительного типа крови своего ребенка (резус-сенсибилизации не произошло).
Отклонение от нормы:
- Прямой тест Кумбса . Положительный результат прямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь имеет антитела, которые борются против эритроцитов. Это может быть вызвано переливанием несовместимой крови или такими заболеваниями, как гемолитическая анемия или гемолитическая болезнь новорожденных (ГБН).
- Непрямой тест Кумбса . Положительный результат непрямого антиглобулинового теста означает, что ваша кровь несовместима с кровью донора. У беременной женщины такие результаты означают присутствие антител против положительного резус-фактора крови ребенка (резус-сенсибилизация). Если ребенок имеет положительный резус-фактор крови, мать будет внимательно наблюдаться врачом на протяжении всей беременности.
Гемолитические анемии , вызванные аутоиммунными телами, которые направлены против собственных эритроцитов, точно не выяснены. Однако предполагается, что какие-то факторы (например, вирус, ненормальный белок) так изменяют эритроциты, что организм воспринимает их уже «как нечто чуждое» и вступает с ними в борьбу с помощью антител. По другой теории, направленные против эритроцитов антитела возникают почти случайно в процессе образования ненормальных белковых тел плазмы при некоторых болезнях. Такие белковые тела, точно так же «случайно», могут дать реакции, которые можно использовать для постановки диагноза (например, вирусная пневмония, как известно, дает положительную реакцию Вассермана, положительную реакцию Пауль - Буннеля и реакцию холодовой агглютинации).
Имеются два главных типа аутоантител при гемолитических анемиях, а именно: тепловые антитела (реагируют при 37°) и холодовые антитела (реактивная способность которых усиливается по мере приближения температуры к нулю). Тепловые антитела встречаются чаще Холодовых. Dacie нашел, что тепловые гемолизины встречаются в 2 раза чаще, чем холодовые. Гемолизины и агглютинины не являются принципиально различными антителами: они различаются только характером их действия. Агглютинины агглютинируют эритроциты, а гемолизины делают их более подверженными сложному процессу гемолиза (комплемент!). Аутоантитела, фиксируясь на эритроцитах, образуют комплекс эритроцит - глобин. Этот комплекс выявляется с помощью антиглобиновой пробы Кумбса.
Проба Кумбса проводится с сывороткой Кумбса, для приготовления которой сенсибилизируют кролика сывороткой человека, против которой в сыворотке кролика образуются антитела. При действии такой сенсибилизированной сыворотки на эритроциты человека наступает их агглютинация, если рецепторы эритроцитов заняты блокирующими антителами. Так как эти блокирующие антитела происходят из сыворотки человека, они дают агглютинацию с сывороткой кролика, сенсибилизированной к плазме человека и содержащей преципитины. Эта реакция названа пробой Кумбса; для гемолитической анемии на почве аутоиммунных тел (Lo tit) она почти специфична (подробности см. у Maier).
В общем при гемолитических анемиях с первичным нарушением эритроцитов проба Кумбса отрицательна, а при приобретенных - положительна. Однако из этого правила имеются некоторые исключения: ложноположительная проба Кумбса найдена при кризах конституциональных гемолитических анемий, а в слабой степени - также иногда после спленэктомии, при ревматическом полиартрите, саркоидозе, после частых переливаний крови и при системной красной волчанке. Естественно, что при приобретенных гемолитических анемиях без образования аутоиммунных тел она отрицательна.
Гемолитические анемии
, вызванные аутоиммунными телами, можно подразделить на:
а) острые, подострые и хронические формы, а также на
б) идиопатические с неизвестной этиологией и в) симптоматические [вирусная пневмония (только холодовые агглютинины), хронический лимфатический лейкоз, ретикулосаркома, лимфосаркома, системная красная волчанка (преимущественно тепловые, реже холодовые агглютинины), сифилис (холодовые агглютинины), опухоли яичников (Miescher с сотрудниками)).
в) симптоматические [вирусная пневмония (только холодовые агглютинины), хронический лимфатический лейкоз, ретикулосаркома, лимфосаркома, системная красная волчанка (преимущественно тепловые, реже холодовые агглютинины), сифилис (холодовые агглютинины), опухоли яичников (Miescher с сотрудниками)).
Клиника гемолитических анемий , развивающихся под действием аутоиммунных тел, очень разнообразна, и вряд ли поэтому можно нарисовать их общую клиническую картину. Поражаются лица всех возрастов и обоих полов равномерно. Все же идиопатические формы как будто чаще наблюдаются у женщин (Sacks и Workman).
Клиническая картина идиопатической формы изменяется в зависимости от тяжести заболевания. В хронических случаях начало постепенно, болезнь тянется многие годы с частыми обострениями. Тяжесть анемии различна в зависимости от степени гемолиза. Наблюдаются падения гемоглобина до 10%, в других случаях гемоглобин длительно удерживается на 50-60%. Интенсивность ретикулоцитоза и желтушной окраски кожи и сыворотки соответствует степени гемолиза. Билирубин в моче находят очень редко, так как он не проходит через почки, но гемоглобинурия наблюдается. Селезенка в хронических случаях чаще увеличена и может даже достигать очень значительных размеров, в других же случаях она еще прощупывается. Печень редко когда не увеличена.
В крови в большинстве случаев наблюдается макроцитоз, в острых стадиях также много микроцитов, редко отсутствуют нормобластоз и полихромазия, лейкоцитоз может достигать 30 000, тромбоциты в норме. В некоторых случаях, однако, имеется выраженная тромбоцитопения. Evans объясняет эти случаи одновременным наличием антител против тромбоцитов, так что налицо имеются одновременно гемолитическая анемия и тромбоцитопения на почве действия аутоиммунных тел- синдром Эванса (Evans). Осмотическая резистентность слегка понижена, но не в такой степени и не так постоянно, как при конституциональной шаровидноклеточной анемии. Проба на устойчивость к нагреванию (Hegglin- Maier) после 6 часов также может дать незначительный гемолиз (собственное наблюдение), но меньшей степени, чем лри анемии Маркиафава. В моче находят также гемосидерин (собственное наблюдение).
Прямая проба Кумбса (антиглобулиновый тест)- положительная реакция определяет антитела (антиэритроцитарные антитела - анти-D, С, Е, с и е) или компоненты комплемента, фиксированные на поверхности эритроцитов в крови больных аутоиммунными гемолитическими анемиями. Отрицательная реакция не исключает иммунное заболевание, поскольку антитела могут находиться в свободном виде в плазме (не связанные с эритроцитами). Для их обнаружения проводят непрямую пробу Кумбса.Показания к назначению: установление иммунной природы гемолитической анемии.
Положительная реакция выражается в том, что эритроциты больного человека, с фиксированными на них антителами, при взаимодействии с антиглобулиновой сывороткой (против антител), полученной после иммунизации кролика, агглютинируют. Прямая проба Кумбса проводится, когда есть основания предполагать, что исследуемые эритроциты уже in vivo подверглись сенсибилизации соответствующими антителами, т.е. первая фаза реакции - фиксация антител на поверхности эритроцитов уже произошла и добавление антиглобулиновой сыворотки вызывает агглютинацию сенсибилизированных клеток. Иными словами, положительная прямая реакция Кумбса подразумевает, что in vivo на поверхности эритроцитов имеются покрыты иммуноглобулины или комплемент.
С помощью прямой пробы Кумбса выявляют иммуноглобулины (антитела) на поверхности эритроцитов. Это иммуноглобулины, образующиеся в ответ на сенсибилизацию к каким-либо антигенам, например резус-фактору. Для постановки пробы сыворотку с антиглобулином (сыворотка Кумбса) добавляют к отмытым эритроцитам. Если на эритроцитах имеются иммуноглобулины или комплемент, происходит агглютинация. Проба называется прямой, так как она одноступенчатая - требует только добавления сыворотки Кумбса к отмытым эритроцитам.
Утверждено приказом Росздравнадзорапо применению «Набора реагентов для определения антигенов и антител системы Резус крови человека»
(АГС для пробы Кумбса)
ТУ 9398-102-51203590-2012
РУ № РЗН 2013/1255 от 11.10.2013
I. ВВЕДЕНИЕ
Стандартная сыворотка для пробы Кумбса содержит специфические гетероиммунные антитела против белка крови человека и предназначена для использования в двух вариантах реакции – прямой и непрямой пробе Кумбса.
Прямая проба Кумбса применяется для определения сенсибилизации эритроцитов in vivo при гемолитической болезни новорожденнных и у больных с аутоиммунной формой хронической гемолитической анемии а также при некоторых других состояниях. Проведение прямой пробы Кумбса заключается в том, что к исследуемым эритроцитам, предварительно отмытым от белков собственной плазмы, добавляется сыворотка для пробы Кумбса. Если эритроциты были сенсибилизированы in vivo, то в результате реакции происходит их агглютинация.
Непрямая проба Кумбса применяется как проба для выявления состояния сенсибилизации организма, позволяющая выявлять антитела, находящиеся в свободном состоянии в сыворотке крови исследуемого лица; как проба на совместимость переливаемой крови, когда исследуется воздействие сыворотки реципиента на эритроциты предполагаемого донора; и как проба для определения различных групповых антигенов в эритроцитах при помощи предварительного воздействия на них стандартных сывороток, содержащих антитела заведомо известной специфичности. Непрямая проба Кумбса (все варианты) производится в два этапа, первым из которых является инкубация исследуемой (или стандартной) сыворотки со стандартными (или исследуемыми) эритроцитами, т. е. сенсибизация эритроцитов in vitro. Второй этап – собственно реакция с сывороткой для пробы Кумбса, которая производится так же, как прямая проба Кумбса.
Конечный результат реакции как в прямой, так и в непрямой пробе Кумбса происходит за счет взаимодействия стандартной сыворотки для пробы Кумбса, с антителами (белком крови человека), фиксированными на эритроцитах. Этот результат проявляется в виде агглютинации эритроцитов. Для наблюдения за агглютинацией следует использовать белую фарфоровую или любую белую пластинку обязательно со смачиваемой поверхностью для того, чтобы наносимые на нее капли хорошо размешивались и не растекались по поверхности пластинки. Перемешанные капли следует слегка размазать по пластинке, приблизительно до размера 2-х копеечной монеты.
II. ПОДГОТОВКА ИНГРЕДИЕНТОВ РЕАКЦИИ
Исследуемую сыворотку для определения в ней наличия и специфичности антител получают из крови обследуемого лица без добавления консерванта. Хранят при температуре + 4–8 0 С не более 2 суток или в замороженном состоянии – срок 1 месяц.
Сыворотку для пробы на совместимость получают таким же способом, но используют со сроком хранения не более 2 суток.
Эритроциты, предназначенные для определения в них тех или иных изоантигенов, заготавливаются с каким-либо консервантом от лица, кровь которого исследуется. Можно также использовать осадок эритроцитов из крови, взятой без консерванта.
При пробе на совместимость используется кровь донора, спущенная через иглу из флакона, приготовленного для переливания.
Во всех случаях эритроциты 3-4 раза отмываются в пробирках от плазмы, путем добавления к одному объему эритроцитов 8-10 объемов изотонического раствора хлорида натрия, с последующим перемешиванием и центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 мин (до полного осаждения эритроцитов). После каждого центрифугирования надстой отсасывается.
III. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ
Испытуемые эритроциты готовят в виде 5% взвеси, для чего одну каплю четырежды отмытых эритроцитов смешивают в пробирке с 19 каплями изотонического раствора хлорида натрия.
Одну каплю (0,05 мл) 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку и размазывают. Пластинку покачивают и в течение 3-х минут наблюдают, не наступила ли агглютинация эритроцитов. Если агглютинация не наступила, то сюда же добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса, капли тщательно перемешивают, после чего пластинку слегка покачивают, затем на одну-две минуты оставляют в покое и снова покачивают. Одновременно в течение 10 минут ведут наблюдение за результатом, который выражается в наличии или отсутствии агглютинации.
Трактовка результатов прямой пробы Кумбса.
Отсутствие агглютинации – отрицательная проба
Наличие агглютинации
– положительная проба, что указывает на сенсибилизацию исследуемых эритроцитов, т. е. на абсорбцию на них антител, происшедшую in vivo в организме человека (новорожденного, больного). Если агглютинация исследуемых эритроцитов наступила до добавления
к ним сыворотки для пробы Кумбса, результат прямой пробы не учитывается.
2. Непрямая проба Кумбса
Предназначенная для выявления изоантител в сыворотке крови обследуемого лица
Применяется в тех случаях, когда необходимо выяснить, содержатся ли в крови больного, беременной женщины, донора и т. д. изоиммунные антитела неполной формы и установить их специфичность. Для реакции используют сыворотку крови обследуемого лица и стандартные эритроциты заведомо известной специфичности. Среди этих 8-10 или более образцов эритроцитов должны быть различия по факторам других систем и очень важно, чтобы каждый из этих факторов содержался хоты бы в одном образце эритроцитов. Также в панель включаются образцы резус-отрицательных эритроцитов с различными сочетаниями антигенов других систем, так, чтобы среди них имелись Даффи-положительные и Даффи-отрицательные, которые, в свою очередь, делились бы на Келл-положительные и Келл-отрицательные, Кидд-положительные и Кидд-отрицательные и т. д. В качестве отрицательного контроля в реакцию по возможности включают эритроциты того лица, сыворотка которого исследуется.
Техника реакции
В штатив устанавливают ряд центрифужных или других пробирок объемом 3-10 мл, по числу образцов эритроцитов, включенных в реакцию. Пробирки маркируют и, согласно маркировке, вносят в них по 1 маленькой капле (0,01 мл) отмытых стандартных эритроцитов. В каждую пробирку накапывают три капли исследуемой сыворотки, пробирки сильно встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации пробирки вынимают из термостата, и эритроциты отмывают путем добавления до верха пробирки изотонического раствора хлорида натрия, перемешивания и последующего центрифугирования. Отмывание повторяют 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая надстой, затем к отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси (при использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за результатом реакции в течение 20 минут.
Трактовка результатов
Отсутствие признаков агглютинации (отрицательный результат) во всех образцах значит, что в исследуемой сыворотке не содержится неполных антител к групповым антигенам, которые содержатся в стандартных эритроцитах, включенных в исследование.Если в некоторых или в большинстве капель, кроме контроля, наблюдается агглютинация , это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела против антигенов эритроцитов. Вопрос о специфичности этих антител решается по сопоставлению положительных и отрицательных реакций с антигенной структурой эритроцитов, включенных в реакцию. Вопрос об активности этих антител решается титрованием.
Пример 1. Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержащими фактор Rh 0 (D), независимо от наличия и от отсутствия других факторов этой системы и других систем, в то время, как со всеми Rh 0 (D) – отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось (так же независимо от наличия или отсутствия других факторов) – это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-резус – Rh 0 (D).
Пример 2 . Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержацими фактор Даффи, независимо от наличия или отсутствия антигенов системы резус и других систем, в то время, как со всеми Даффи-отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-Даффи.
Дополнение. В случае, если в учреждении не имеется полной панели стандартных эритроцитов, но есть необходимость в исследовании сыворотки на наличие антител, рекомендуется провести исследование с 25-30 произвольно взятыми образцами эритроцитов здоровых лиц группы 0 (I) или одноименной с исследуемой сывороткой. Это даст возможность решить вопрос о наличии или отсутствии антител к большинству антигенов системы Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд.
При получении положительного результата дальнейшее заключение о специфичности выявленных антител может быть решено при специальном исследовании с полной панелью стандартных эритроцитов.
3. Техника проведения непрямой пробы Кумбса, как пробы на совместимость переливаемой крови
Для предупреждения несовместимости при переливании крови, перед трансфузией обязательно должны быть произведены следующие пробы на совместимость:
Проба на совместимость по группам крови АВО, которая производится на плоскости при комнатной температуре.
Пробы на совместимость по резус-фактору и другим изоантигенам.
Одну маленькую (0,01 мл) каплю отмытых эритроцитов донора, взятых через иглу из флакона с кровью, предназначенной для переливания, переносят на дно центрифужной или другой пробирки объемом 3-4 мл и добавляют в нее 3 капли сыворотки больного. Пробирку встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой, после чего помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации добавляют в пробирку доверху изотонический раствор хлорида натрия, содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют 5-10 мин. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3 раза, каждый раз тщательно удаляя надстой. При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием. К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси.
1 каплю 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Затем пластинку слегка покачивают, на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая результат в течение 20 минут.
Примечание:
При несовместимости по резус-фактору агглютинация обычно наступает в течение первой минуты, однако при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить позже, иногда к двадцатой минуте.
Трактовка результата:
Агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне – это значит, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не может быть ему перелита.
Отсутствие признаков агглютинации означает, что кровь больного не содержит неполных антител к эритроцитам донора в отношении резус-фактора и других изоантигенов, к которым могли образоваться антитела неполной формы.
Непрямая проба Кумбса является чувствительной только в отношении неполных антител.
4. Техника непрямой проба Кумбса для определения антигенной структуры эритроцитов
Данная проба используется для определения наличия или отсутствия какого-либо группового антигена эритроцитов при помощи стандартной сыворотки, содержащей соответствующие антитела в неполной форме.
Наиболее часто непрямая проба Кумбса используется при определении антигенов Келл (К), Даффи (Fy), Кидд (Jk), и также для определения слабого антигена системы резус (Du).
Прежде, чем приступить к определению антигенов, исследуемые эритроциты следует проверить в прямой пробе Кумбса. При положительном результате прямой пробы – определение антигенов непрямой пробой Кумбса провести нельзя и для этой цели нужно применить другие реакции.
Для реакции используют центрифужние или другие пробирки объемом 3-4 мл в количестве трех: одну – для исследуемого образца эритроцитов и две для На дно первой пробирки вносят 1 маленькую (0,01 мл) каплю трижды отмытых испытуемых эритроцитов, во вторую - контрольные эритроциты, содержащие искомый антиген (например, Даффи- положительные) и в третью пробирку – отрицательный контроль (Даффи – отрицательные). Во все пробирки добавляют по 2-3 капли стандартной сыворотки (в данном примере анти-Даффи). Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После такой инкубации пробирки вынимают из термостата, доливают в них доверху изотонический раствор хлорида натрия, тщательно перемешивают содержимое и центрифугируют при1500-2000 тыс. об/мин в течение 5-10 мин. После центрифугирования надстой тщательно отсасывают и такое отмывание эритроцитов повторяют 4 раза. (При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).
К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси. 1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, к каждой капле эритроцитов добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 20 минут.
Трактовка результатов
Наличие агглютинации эритроцитов (положительный результат) означает, что кровь содержит искомый антиген (в данном примере – кровь Даффи-положительная).
Отсутствие агглютинаци (отрицательный результат) означает, что исследуемая кровь не содержит искомого антигена (Даффи-отрицательная).
Результат учитывается как истиный после проверки контрольных образцов, т. е. в примере при положительном результате с Даффи-положительным образцом и отрицательном – с Даффи-отрицательным образцом.
5. Форма выпуска
Реактив выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
6.Хранение
Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон годен к использованию при хранении в холодильнике в герметично закрытом виде в течение всего срока годности.
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, истекший срок годности реагента. При составлении рекламации просим указать дату получения, поставщика (если Вы получили товар не от производителя), номер серии, причины, по которым реагент признан негодным. Просим приложить протокол с результатами проверки реагента и 2-3 невскрытых флакона с реактивом
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель ООО «МЕДИКЛОН»: 127276